非酒精性脂肪性肝病是一种常见肝脏疾患，有逐年增加的趋势。近年的研究认为氧应激和脂质过氧化反应是其发病机制的轴心［1］。血红素加氧酶（HO）是血红素降解的起始酶和限速酶,HO-1为其诱导型。众多证据表明，各种体内及体外氧化性损伤模型中HO-1提供了细胞保护作用，因而认为HO-1的诱导是机体对抗氧应激的一种代偿机制［2］。本文在建立大鼠高脂饮食脂肪性肝炎模型的基础上，探讨非酒精性脂肪性肝炎中HO-1的表达情况及其与氧应激的关系，为进一步研究HO-1在非酒精性脂肪性肝炎中的作用提供依据。材料与方法 一、动物模型的建立和分组 雄性Wistar大鼠20只，体重 170 ～ 200 g，普通饲料喂养1周后随机分成2组：正常组（普通饲料喂养）和模型组（高脂饲料喂养），每组10只。高脂饲料内含87.7%普通饲料、10%猪油、2%胆固醇和0.3%胆盐。动物分笼喂养，自由饮水和进食，室温23℃，湿度50％，明暗各12 h。造模12周后处死动物。 二、观察指标及测定方法 （一） 一般情况观察动物体重、死亡情况，实验结束后计算肝指数(肝脏湿重/体重×100％) （二） 血清生化指标测定12周造模结束前一天，所有动物禁食12 h，次日以3％戊巴比妥钠(1 ml/kg)腹腔注射麻醉后迅速称重，腹主动脉插管取血6 ml，室温下放置2 h后，4℃ 4 000×g离心，分离血清-20℃冻存。检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)。 （三） 肝组织匀浆生化测定动物麻醉打开腹腔后取新鲜肝右叶1 g,4℃下制成10%的生理盐水肝匀浆，4℃ 4 000×g离心后取上清－20℃冻存，按试剂盒说明书测定丙二醇(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPX)；取新鲜肝组织（1 g左右），加入适量的抽提液（氯仿∶甲醇体积百分比为1∶1，（质量体积比为1∶9），制成10％的匀浆，4℃ 4 000×g离心,取上清-20°C冻存。TG、TC含量测定按试剂盒说明书进行。考马斯亮兰法测肝匀浆蛋白浓度。 （四） 病理学检查肝左叶相同部位取样，4％的中性甲醛溶液固定，石蜡切片，HE染色,光镜下观察肝组织病理变化。对肝细胞脂肪变程度进行分级。炎症活动度积分参考文献［3］。 （五） 免疫组织化学染色采用链霉菌抗生物素蛋白－过氧化酶免疫组织化学法（SP法），DAB显色，一抗HO-1的浓度为1∶200，每次试验均设阴性对照，以PBS液代替一抗。 三、统计学处理 计量资料以±s表示，组间比较采用Student's t 检验;等级资料采用Ridit分析，相关性分析采用直线相关检验。所有分析均在SPSS 10.0统计软件中进行。 结果 一、一般情况 造模开始时两组体重无差别,12周末无一例动物死亡，模型组大鼠食欲好，体重增长较快；肝湿重、肝指数模型组比正常对照组明显增加（P<0.05，见表1）。表1（略） 二、大鼠血清生化测定 与正常对照组比较，模型组大鼠血清ALT、AST、TC水平显著增高；血清TG水平降低(见表2)。表2（略） 表3（略） 三、 大鼠肝匀浆生化测定 模型组大鼠肝脏TC、TG明显高于正常组(P＜0.01 )。与正常对照组比较，模型组大鼠肝匀浆MDA值明显增加(P<0.01)，GSHPX值明显减低（P<0.01）。 四、大鼠肝脏组织病理学检查 （一） 肝脏外观及病理学改变正常组肝脏外观呈红褐色，质地软而富有弹性;模型组肝脏体积增大，边缘钝而厚，表面光滑，表面及切面呈黄色，有油腻感。光镜下正常组大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索排列整齐。模型组均出现中～重度脂肪变性，以及程度不等的小叶内灶性炎细胞浸润。肝细胞索排列紊乱，脂变肝细胞体积增大，胞浆内可见大小不等、数量不一的空泡，胞浆空泡以大泡型为主，部分胞核被挤压移位；浸润的炎细胞以单核细胞为主,未见纤维间隔形成。脂肪变性程度见表4。正常对照组和模型组炎症活动度积分分别为0.10±0.32 和2.60±1.17，两组炎症积分的差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。表4（略） （二） HO-1免疫组织化学结果免疫组织化学结果显示，HO-1蛋白定位于肝细胞质内。正常对照组HO-1蛋白主要在中央静脉周围的肝细胞表达(见图1)，模型组中除中央静脉周围的肝细胞表达外，发生脂肪变性区域也表达(见图2)。正常对照组和模型组每个视野HO-1蛋白阳性的平均细胞数分别为21.40±5.44和48.6±7.66，两组比较差异具有显著统计学意义（P＜0.01）。图1（略） 五、HO－1蛋白表达阳性细胞计数与GSHPX、MDA值相关性比较 正常对照组肝脏HO-1蛋白阳性表达细胞数与肝匀浆MDA值及GSHPX活力无相关性（r=-0.026，P=0.943；r=-0.026，P=0.943）；模型组HO-1蛋白阳性表达细胞数与MDA值呈正相关(r=0.786，P=0.007)，与GSHPX活力呈负相关(r=-0.718，P=0.019)。图2（略） 讨论 本研究成功复制营养性大鼠非酒精性脂肪性肝炎模型。 模型组大鼠肝内GSHPX的含量显著低于正常组, MDA含量显著高于正常组, 表明肝脏脂肪变性时肝内抗氧化反应酶活性减低, 脂质过氧化反应增强，与文献［4］的结果一致，提示氧应激和脂质过氧化反应参与了非酒精性脂肪性肝炎的发生。 HO－1是血红素加氧酶的同工酶，分解血红素产生一氧化碳（CO）、游离铁和胆绿素，胆绿素被胆绿素还原酶转化为胆红素。胆绿素及胆红素均具有抗氧化功能，CO则能激活鸟苷酸环化酶，使cGMP生成增加发挥组织细胞保护效应。血红素降解过程中产生的亚铁能诱导转铁蛋白表达，后者可减少自由基产生，发挥抗氧化作用。本实验结果显示，模型组大鼠肝脏HO-1的表达较正常组明显增加，并且与GSHPX值的降低存在负相关，与MDA值的升高存在正相关。另一方面，研究认为，氧化应激、还原型谷胱甘肽（GSH）耗竭是HO-1表达的诱导因素，因此模型组HO-1表达增强可能与非酒精性脂肪性肝炎中氧应激和脂质过氧化反应的诱导有关。这与Malaguarnera等［5］对非酒精性脂肪性肝炎、单纯性脂肪肝以及正常人肝脏中HO-1表达的研究结果相一致。HO-1通过抗氧应激对扑热息痛和四氯化碳等诱导的急性肝衰竭以及脂多糖诱导肝损伤模型起保护作用［6-8］。因此我们推测，非酒精性脂肪性肝炎中HO-1的表达增加可能是机体对抗氧应激和脂质过氧化反应的一种保护机制。 参考文献 1Day CP, James OF. Steatohepatitis:a tale of two“hits”? Gastroenterology, 1998, 114:842-845. 2Otterbein LE, Choi AM. Heme oxygenase: colors of defense against cellular stress. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol， 2000, 279: L1029-L1037. 3王泰龄，刘霞，周之平，等.慢性肝炎炎症活动度及纤维化程度积分方案.中华肝脏病杂志，1998，6：195-197. 4戴宁，曾民德，李继强，等.非酒精性脂肪肝肝细胞色素P450ⅡE1的表达与氧化抗氧化的关系.中华肝脏病杂志，1999，7：104-106. 5Malaguarnera L, Madeddu R, Palio E, et al. Heme oxygenase1 levels and oxidative stressrelated parameters in nonalcoholic fatty liver disease patients. J Hepatol, 2005,42：585-591. 6Chiu H, Brittingham JA, Laskin DL.Induction of heme oxygenase(HO-1) in the liver following acetaminophen administration to rats:protection by hemin and biliverdin. Toxicol Appl Pharmacol, 2002,181：106-115. 7Nakahira K, Takahashi T, Shimizu H, et al. Protective role of heme oxygenase1 induction in carbon tetrachlorideinduced hepatotoxicity. Biochem Pharmacol, 2003,66:1091-1105. 8Fujii H, Takahashi T, Nakahira K, et al. Protective role of heme oxygenase1 in the intestinal tissue injury in an experimental model of sepsis. Crit Care Med，2003, 31：893-902. 上海《肝脏》杂志社版权 |