【摘要】 目的 为进一步寻找和克隆可能的肝癌转移抑制基因奠定基础。 方法 以序列标签位点（STS）为路标，运用基因组物理图谱方法分析人类染色体8p上肝癌转移抑制基因相关染色体缺失状况，从NCBI的UniSTS数据库查询STS的引物序列，以微细胞杂交克隆DNA为模板（A9/C5F-1和A9/C5F-2为转移不抑制组，A9/C5F-4、A9/C5F-8和A9/C5F-10为转移抑制组）进行STS-PCR扩增。 结果 人类染色体8p上从D8S542位点起至D8S1973位点区段（位于染色体8p21.1～23.1区域，约18cM）存在转移抑制组杂交克隆STS位点不同程度的获得和转移不抑制组杂交克隆组STS位点的缺失。 结论 D8S542～D8S1973所在的人类染色体8p21.1～23.1区域可能存在肝癌转移抑制基因。 【关键词】 癌，肝细胞； 转移； 转移抑制基因; 序列标记位点 Functional localization of metastasis suppressor genes for HCC on human chromosome 8 SONG Li-jie, YE Sheng-long, WANG Kai-feng, LIANG Chun-min, LIU Hu, SUN Rui-xia, ZHAO Yan, TANG Zhao-you.First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Liver Cancer Institute and Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China Corresponding author: YE Sheng-long, Email: slye@ shmu.edu.cn 【Abstract】 Objective We previously showed that introduction of a normal, neomycin-tagged human chromosome 8 reduced the metastatic capacity of C5F rat liver cancer cell line, which had high metastatic potential without affecting tumorigenicity, suggesting the presence of one or more metastasis suppressor genes encoded on human chromosome 8. We proceeded to define further the region harboring the metastasis suppressor gene(s) and to determine the random loss of human chromosome 8 by PCR amplification of sequence tag site (STS) markers. Methods The national Center for Biotechnology Information (NCBI) databases were used as references of the relative genetic distances of the STS markers. C5F genomic DNA and A9/neo8 genomic DNA were used as negative and positive controls for chromosome 8 amplification, respectively. Genomic DNA was isolated and quantified from cultured hybrid clones (A9/C5F-1 and A9/C5F-2 microcell hybrid clones served as metastasis-unsuppressed groups; A9/C5F-4, A9/C5F-8 and A9/C5F-10 microcell hybrid clones served as metastasis suppressed groups). STS-PCR products were separated by electrophoresis through 2% agarose gel. Results Metastasis-suppressed microcell hybrid clones (A9/C5F-4, A9/C5F-8 and A9/C5F-10) conserved STS markers between D8S542→D8S1973 (8p21.1-23.1). In contrast, metastasis-unsuppressed clones (A9/C5F-1 and A9/C5F-2) lacked several markers in this region. In attempts to refine the region retained in the microcell suppressed clones, more densely spaced STS markers in the human chromosome 8p21.1-23.1 were used. We found that the metastasis-suppressed clones retained 18cM region between D8S542 and D8S1973 (8P21.1-23.1), where as the metastasis-unsuppressed clones lacked the region. Conclusion Our results suggest that a metastasis suppressor gene is located within the interval between D8S542 and D8S1973 on human chromosome 8p21.1-23.1. 【Key words】 Carcinoma, hepatocellular; Metastasis; Metastasis suppressor genes; Sequence tagged sites 肝癌复发转移的分子机制仍不清楚，未发现与肝癌转移直接有关的转移抑制基因。我们在前期研究中将人类完整的8号染色体导入高转移大鼠肝癌细胞系C5F中，成功抑制肿瘤转移灶的形成，而对原发肿瘤没有影响，推测人类8号染色体短臂（8p）上存在一个或多个肝癌转移抑制基因[1, 2]。本研究在此基础上以人类染色体上序列标签位点（sequence tag site, STS）为路标，用基因组物理图谱的方法分析8p上肝癌转移抑制基因相关染色体缺失状况，为进一步寻找可能的肝癌转移抑制基因奠定基础。 材料与方法 一、细胞系与微细胞杂交克隆 人8号染色体供体细胞-A9（neo8）：含有正常人8号染色体的小鼠成纤维细胞，8号染色体上被随机标记neo抗性基因，购自日本JCRB细胞库，目录号：JCRB2208。 高转移大鼠肝癌C5F细胞系：日本名古屋城市大学病理系K.Ogawa博士馈赠，本研究所传代使用。微细胞杂交克隆：通过微细胞介导的染色体转移方法将标记有耐药基因neo的人类正常8号染色体导入到大鼠肝癌高转移细胞系C5F中，用G418和HAT进行双重药物筛选，单细胞分离克隆获得具有双重抗性的微细胞杂交克隆。通过自发转移动物实验将其分为转移抑制杂交克隆和转移不抑制杂交克隆。本实验从中选取5种杂交克隆：转移抑制杂交克隆（A9/C5F-4、A9/C5F-8、A9/C5F-10），转移不抑制杂交克隆（A9/C5F-1、A9/C5F-2）。 二、主要试剂与仪器 1．主要试剂与仪器：HotStar Taq DNA聚合酶（目录号203203），购自德国Qiagen公司；10mmol/L dNTP Mix（目录号R0192），购自美国MBI公司；100×HAT (10mmol/L次黄嘌呤，40μmol/L氨基蝶呤，1.6mmol/L胸腺嘧啶脱氧核苷)，购自美国Gibco BRL公司；5U/μl Taq DNA聚合酶及其10×缓冲液、25mmol/L MgCl2均购自MBI公司；Geneticin（G418硫酸盐），购自美国Gibco BRL公司；25cm2、75cm2细胞培养瓶，15ml离心管及96孔、24孔、6孔细胞培养板均购自美国Corning Costar公司；1.8ml细胞冻存管，购自美国Nunc公司；0.2ml无RNA酶的薄壁PCR管，购自美国Axygen公司；0.22μmol/L滤器，购自美国Millipore公司；PCR仪（PCT100-96型），购自美国MJ公司，基因组DNA提取试剂盒购自上海华舜公司。 2. 冻存细胞克隆的复苏培养：将保存细胞的冻存管37℃水浴尽快融化，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并加10倍以上培养液，混合后低速离心，除去上清液，重复洗涤1次；用培养液适当稀释后，接种于培养瓶，用含10%胎牛血清的DMEM在5% CO2培养箱内培养。24h后换选择培养基培养,每3d更换新鲜培养液；培养至细胞95% 融合时以0.25%胰酶消化后1∶3传代；收集对数生长期细胞准备提取基因组DNA进行检测。 3. 基因组DNA提取：200μl样品中加入400μl 细胞裂解液, 混匀后加入3μl蛋白酶K置于55℃ 5～10min，中途上下混匀几次；加入600μl氯仿，混匀；10000r/min离心2min，取500μl上层清液，置于无菌1.5ml离心管中；加入500μl Solution P，混匀，室温放置2min；室温高速离心，10000r/min，2min。吸掉上清液，立即加入100μl 1.2mmol/L NaCl，轻轻振荡直至DNA样品完全溶解，加入3μl Rnase A，混匀，置于55℃ 5～10min；加入300μl 冷乙醇，-20℃放置10min，10000r/min，高速离心3～4min，吸走或倒掉乙醇，用70%乙醇洗1次；倒置于干净的滤纸上，室温干燥10min，DNA用100μl水或TE溶解。用紫外分光光度计测量DNA纯度。A260/A280＝1.8的DNA样本为合格样本。 4. STS-PCR：大鼠肝癌高转移系C5F为阴性对照，染色体供体细胞A9（neo8）为阳性对照，微细胞杂交克隆DNA为模板（A9/C5F-1和A9/C5F-2为转移不抑制组，A9/C5F-4、A9/C5F-8和A9/C5F-10为转移抑制组）进行STS-PCR。从NCBI的UniSTS数据库查询STS的引物序列, 由上海生物工程技术服务有限公司、上海博亚生物技术有限公司合成。所选取的STS在染色体上的位置、引物序列及扩增产物长度,见表1。 50μl荧光定量PCR体系含有10×PCR反应缓冲液5μl，dNTP Mix（10mmol/L）1μl，上下游引物（10μmol/L）各1μl，HotStar Taq DNA聚合酶（5U/μl）0.3μl，模板DNA 1μl，加ddH2O至50μl。每个反应设置3个复孔。PCR热循环参数：95℃ 15min预变性；94℃ 45s，55℃～68℃ 45s，72℃ 1min，30个循环；72℃ 10min。 结 果 1. 微细胞杂交克隆培养：刚复苏出的微细胞杂交克隆用高糖DMEM培养基培养，2d后换含有HAT（1×）和G418（0.8mg/ml）的双重选择培养基培养，以后持续使用双重选择培养基。复苏后第3天使用双重选择培养基培养的微细胞杂交克隆，具有双重抗性的细胞成团生长，细胞饱满，折光度高。培养第5天出现单个A9/C5F-4微细胞杂交克隆见图1。 2. 第一次筛选：转移不抑制组微细胞杂交克隆存在人类8号染色体D8S462至D8S1672区段和D8S278至D8S1675区段上的所有STS位点, 转移抑制组微细胞杂交克隆除个别缺失（A9/C5F-4克隆缺失D8S462和D8S1118位点, A9/C5F-10克隆缺失D8S1118位点）外，也都获得这些STS位点；而D8S542至D8S1973位点所在区段则存在不同程度的转移不抑制组微细胞杂交克隆STS位点的缺失和转移抑制组微细胞杂交克隆STS位点的获得。D8S542至D8S1973位点约18cM，位于人类染色体8p21.1～23.1区段，推测在此区段存在可能的肝癌转移抑制基因，见表2。 讨 论 肝癌术后复发转移的防治研究已成为肝癌研究的一大热点。但迄今肝癌复发转移的分子生物学机制仍不清楚。寻找与肝癌复发转移相关基因和新的干预治疗靶点具有重要意义[3]。我们在以往研究的基础上推测在人类染色体上存在肝癌转移抑制基因，若能证实确实存在并克隆肝癌转移抑制基因，对于肝癌转移分子机制的阐明和肝癌的诊断、治疗与预后评估都具有重要意义。 微细胞介导的染色体转移（MMCT）是一种建立在体细胞杂交基础之上的实验方法，结合STS-PCR对染色体片段缺失情况的定位分析，适用于转移抑制基因的功能定位研究。多数肿瘤转移抑制基因都是通过MMCT发现的[4]。通过这种方法将前列腺癌相关转移抑制基因定位于人类染色体7q21-22/7q31.2-32、8p21-p12、10cen-10q23、11q11.2-13、12qcen-q13/12q24-ter、13[5]、16q24.2、17p12-11.2/17cen-q12、20p11.23-12[6]，并克隆了前列腺癌转移抑制基因KAI-1、MKK4。将KAI-1导入高转移人前列腺癌细胞中，能抑制转移潜能而不影响裸鼠体内的成瘤性[7]。KAI-1对多种肿瘤转移有抑制作用具有非特异性。MKK4/SEK1表达与Gleason分级呈负相关，有可能成为预测前列腺癌转移潜能的生物学指标[8]，对黑色素瘤和卵巢癌同样具有抑制作用[9]。乳腺癌转移抑制基因功能定位于人类染色体6、11q13.1-13.2、11pter-q14[6]，并发现了转移抑制基因BRMS1。已证实BRMS1亦能抑制黑色素瘤转移潜能[10]。黑色素瘤转移抑制基因功能定位于染色体1、6q16.3-q23[11]。目前国际上有关转移抑制基因的研究主要集中在前列腺癌、乳腺癌和黑色素瘤，有关肝癌的转移抑制基因仍鲜见报道。 我们前期工作为肝癌转移抑制基因的研究提供了重要线索。我所在肝癌组织原位移植建立的裸鼠肝癌高转移模型之上建立了人肝癌高转移细胞系MHCC97，并通过CGH方法对MHCC97中染色体LOH情况进行了分析，发现该细胞系8p存在LOH[12]。应用CGH方法分析了10例肝癌手术标本原发灶与转移灶的基因组畸变，发现8例转移灶中存在8p缺失，而原发灶中只有3例，提示8p在肝癌转移中起重要作用[13]。随后又通过全基因组扫描证实8p存在较为明显的等位基因失衡，并进一步发现8p23.3、8p11.2区域上LOH更为明显[10]。以上结果提示8号染色体上可能存在肝癌转移抑制基因。我所前期运用MMCT方法将人类8号染色体导入高转移大鼠肝癌细胞系C5F[5]，用G418和HAT进行双重筛选，分离得到15个单细胞克隆。通过自发肺转移实验对其中的10个微细胞杂交克隆(A9/C5F1-10)在裸鼠中的转移表型进行了分析，发现6个杂交克隆（A9/C5F-3,4,5,8,9,10）出现转移表型的显著抑制，其中2个杂交克隆(A9/C5F4,8)转移表型发生完全抑制。根据转移表型差异将这些杂交克隆分为转移抑制组（A9/C5F-3,4,5,8,9,10）和转移不抑制组（A9/C5F-1,2,6,7）[3]。取A9/C5F-1,2杂交克隆为转移不抑制组，A9/C5F-4,8,10为转移抑制组通过基因组物理图谱定位的方法检测导入8号染色体上的片段丢失情况。 STS指染色体定位明确，并可用PCR扩增的单拷贝序列，人类物理图谱的绘制就是以STS为标记位点，具有惟一性。我们根据NCBI的UniSTS数据库资料选择20个STS，均匀覆盖整个8p染色体，平均间隔2cM，进行STS-PCR测定。 由第一次筛选结果来看，在8p染色体上从D8S542位点起至D8S1973位点区段，在转移不抑制组杂交克隆存在STS位点的不同程度的缺失和转移抑制组STS位点的获得。D8S542-D8S1973位于染色体8p21.1～23.1区域，初步推测在人类染色体8p21.1～23.1区段存在可能的肝癌转移抑制基因。在人类8号染色体导入高转移细胞系C5F时，由于染色体的不稳定性会发生某些区段的随机丢失，每个杂交克隆所携带的目的染色体的区段不同。从我们筛选的结果看，存在转移抑制组获得8号染色体片段的不一致性，考虑是染色体在随机丢失的结果，亦提示在肝癌的转移抑制中可能是8p上的不同片段在起共同的作用，而非一个。在我们上述提到的转移抑制组获得的染色体的片段中都有可能包含有我们所要寻找的肝癌转移抑制基因。在8p21.1～23.1上可能存在一个或多个肝癌转移抑制基因在发挥作用，为肝癌转移抑制基因的克隆定位奠定了基础。 参 考 文 献 [1]Liu H, Ye SL, Yang J, et al. 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