【摘要】 目的 研究HBV/P22蛋白对肿瘤坏死因子（TNF）α诱导的HepG2细胞凋亡的影响。 方法 用放线菌素D和TNFα分别诱导表达HBV/P22蛋白的HepG2细胞（实验组）、表达空载体的HepG2细胞（阴性对照组）和HepG2细胞（空白对照组）凋亡，雅培试剂检测细胞上清液中HBeAg的表达，Western blot及免疫细胞化学法检测HBV/P22蛋白表达，流式细胞仪和末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡。体内实验：将前述三种细胞分别注射入裸鼠皮下，放线菌素D、TNFα注射瘤体后，免疫组织化学法检测组织HBV/P22蛋白的表达，TUNEL法检测组织细胞凋亡率。 结果 实验组细胞培养上清液中HBeAg表达阳性，两对照组阴性；Western blot及免疫细胞化学法检测均显示实验组细胞有HBV/P22蛋白表达，两对照组均为阴性；流式细胞仪和TUNEL结果均显示实验组细胞凋亡率明显低于两对照组（P<0.05）。体内实验：实验组瘤体组织免疫组织化学检测结果显示HBV/P22蛋白表达阳性，TUNEL检测结果显示接种表达HBV/P22蛋白的HepG2细胞裸鼠瘤组织细胞凋亡率明显低于两对照组（P<0.05）。 结论 HBV/P22蛋白在体内外均可抑制TNFα诱导的HepG2细胞凋亡。
【关键词】 癌，肝细胞； 细胞凋亡； HBV/P22蛋白
The influence of HBV/P22 protein on the apoptosis of HepG2 cells: an experimental study ZHANG Fan*, DIAO Zhi-hong, YU Zhi-jian, ZHANG Ming-xia, ZHU You-fu. *Department of Infectious Diseases, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
Corresponding author: ZHU You-fu, Email: zhuyf0118@ 163.com
【Abstract】 Objective To study the influence of HBV/P22 protein on the induced apoptosis of HepG2 cells. Methods In vitro, two HepG2 strains were transfected with pcDNA3.1+ and pcDNA3.1+HBV/P22 respectively and the cells were exposed to Act D and TNFα for 6h and then the induced apoptosis was detected by flow cytometry (FCM) and TUNEL technique. Supernatant HBeAg was detected by Abbott reagent. The intracellular expression of HBV/P22 protein was measured by Western blot and immunochemistry. In vivo, three cell groups were inoculated into nude mice by subcutaneous injections. After two weeks, Act D and TNFα were injected into the tumors and then the induced apoptosis in the tissues was detected by TUNEL technique. The expression of HBV/P22 protein in the tumor tissues was detected by immunochemistry. Results In vitro, in HepG2- pcDNA3.1+HBV/P22 cells, supernatant HBeAg was positive and intracellular HBV/P22 protein was positively expressed. The apoptosis proportion of HepG2-pCDNA3.1+HBV/P22 cells was markedly lower than HepG2 and HepG2-pcDNA3.1+ cells (P < 0.05). In vivo, HBV/P22 protein was expressed in the tumor tissues, and the apoptosis proportion in the group injected with HepG2-pcDNA3.1+HBV/P22 cells was markedly lower than those injected with HepG2 and HepG2-pcDNA3.1+cells (P < 0.05). Conclusion HBV/P22 protein could inhibit the induced apoptosis of HepG2 cells both in vitro and in vivo.
【Key words】 Carcinoma, hepatocellular; Apoptosis; HBV/P22 protein
HBV前C/C基因编码的蛋白质与乙型肝炎发病机制较为密切，前C/C基因有2个开放读码框，分别合成2.1×104的HBcAg（P21）和2.5×104的前C/C蛋白（P25），HBV/P25蛋白在内质网上截去信号肽后生成HBV/P22蛋白，大部分HBV/P22蛋白水解掉C-端肽段形成相对分子质量1.7×104的HBeAg后向细胞外分泌，小部分HBV/P22蛋白仍滞留于胞质内[1]。目前关于滞留于胞质内的HBV/P22蛋白功能研究鲜见报道。我们近年的研究显示，前C/C基因编码的HBcAg影响诱导的细胞凋亡，但HBV/P22蛋白是否同样影响细胞凋亡尚鲜见报道。我们用南方医科大学南方医院感染内科实验室构建的稳定表达HBV/P22蛋白的HepG2细胞株初步研究HBV/P22蛋白对肿瘤坏死因子（TNF）α诱导的人肝癌细胞HepG2凋亡的影响。
材料与方法
1. 材料：人肝癌细胞株HepG2由南方医科大学南方医院感染内科实验室保存，前期我们用HepG2细胞分别转染pcDNA3.1+空白质粒和表达HBV/P22蛋白的pcDNA3.1+HBV/P22质粒，经G418筛选，挑选单克隆细胞株，鉴定并保存HepG2空白质粒细胞株（HepG2-pcDNA3.1+）和稳定表达HBV/P22蛋白的HepG2细胞株（HepG2-pcDNA3.1+HBV/P22）[2]。胎牛血清购自澳大利亚PAA公司；TNFα购自美国Pepro Tech EC公司；放线菌素D（Act D）购自瑞士Alexis公司；Annexin V-FITC试剂盒、末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL）试剂盒购自南京凯基公司；G418、HBeAg单克隆抗体分别购自美国Gibco、ViroStat公司；Tritonx-100购自北京鼎国公司；免疫组织化学通用试剂盒购自深圳晶美公司；Protein DetectorTM LumiGLO Western blot试剂盒、X光胶片及显影定影试剂、雅培试剂分别购自美国KPL、Kodak、雅培公司。
2. 实验动物：BALB/c-nu/nu裸鼠24只，4～6周龄，体重17～20g，雌雄各半，由南方医院实验动物中心提供并饲养 。
3. HBeAg和HBV/P22蛋白的检测：HepG2（空白对照组）、HepG2-pcDNA3.1+（阴性对照组）、HepG2-pcDNA3.1+HBV/P22（实验组）细胞用含体积分数10%胎牛血清的DMEM完全培养液（HepG2-pcDNA3.1+、HepG2-pcDNA3.1+HBV/P22的DMEM完全培养液含终浓度500mg/L的G418，以下均同）培养，置37℃、5% CO2中培养。各组细胞分别以1×106/孔接种于6孔板，3d后收集上清液，雅培试剂检测HBeAg表达水平，HBeAg含量S/CO参考值<2.1为阴性。各组细胞分别取1×107个裂解，进行HBV/P22蛋白的Western blot检测，步骤按Western blot检测试剂盒说明书进行。
4. 流式细胞仪检测细胞凋亡：HepG2、HepG2-pcDNA3.1+和HepG2-pcDNA3.1+HBV/P22细胞以3×105/孔，接种于12孔板，24h后磷酸盐缓冲液冲洗；每孔加入1ml含终浓度为333μmol/L Act D的新鲜培养液，30min后每孔加入TNFα 100μg/L。作用6h后，胰酶消化，离心收集细胞，磷酸盐缓冲液洗涤2次，收集2×105个细胞；加入500μl的结合缓冲液重悬细胞；加入2μl Annexin V-FITC混匀，避光、室温反应5min；加入5μl碘化丙啶，混匀，避光、室温反应5min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
5. HepG2细胞HBV/P22蛋白的免疫细胞化学和TUNEL测定：各细胞株以3×105/孔 接种于放有盖玻片的6孔板中，细胞培养3d，长满玻片85%左右时，按免疫细胞化学常规步骤操作，用HBeAg单克隆抗体检测HBV/P22蛋白表达。另取各组细胞按方法4依次加入ActD和TNFα，6h后，丙酮固定15min，TUNEL检测按试剂盒说明书操作，二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化，脱水、透明、封片。阳性细胞判断标准：细胞核呈棕黄色染色为阳性，无细胞核棕黄色染色为阴性。随机取5个视野，高倍镜下（×400）观察计数阳性细胞百分率。
6. 裸鼠动物模型的建立：BALB/c-nu/nu裸鼠24只，随机分为3组。收集培养的HepG2、HepG2- pcDNA3.1+和HepG2-pcDNA3.1+HBV/P22细胞，磷酸盐缓冲液洗3次。取5×107个细胞重悬于不含血清的培养液0.1ml中，分别注射于裸鼠的颈背部皮下。接种2周后，瘤体积平均值为100mm3左右，开始诱导细胞凋亡：瘤内直接注射Act D 330nmol，30min后，再注射150ng的TNFα，连续用药5d， 1次/d。停药后第2天，处死裸鼠，收集瘤体标本。
7. 肿瘤组织HBV/P22蛋白的免疫组织化学和TUNEL测定：肿瘤组织切片常规脱蜡水化，按免疫组织化学常规步骤操作，用HBeAg单克隆抗体检测HBV/P22蛋白表达。TUNEL检测按试剂盒说明书操作；DAB显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化，脱水、透明、封片。阳性细胞判断标准同前，随机取5个视野，高倍镜下（×400）观察计数阳性细胞百分率。
8. 统计学分析：实验结果均以x-±s表示，应用SPSS10.0分析软件进行方差分析。
结 果
1. HBeAg和HBV/P22蛋白的检测结果：雅培试剂检测HepG2-pcDNA3.1+ HBV/P22细胞培养上清液HBeAg表达为阳性（S/CO＝3.15）,两对照组均为阴性。三种细胞Western blot检测结果显示，HepG2-pcDNA3.1+HBV/P22细胞有明显的HBV/P22蛋白表达，两对照组均为阴性（图1）。免疫细胞化学检测结果与Western blot检测结果一致（图2）。三种细胞分别注射入裸鼠皮下，2周后以Act D、TNFα局部注射瘤体诱导细胞凋亡，1周后取出瘤体组织，HE染色观察瘤体形态良好（图3）；免疫组织化学检测组织HBV/P22蛋白的表达，结果显示注射HepG2-pcDNA3.1+HBV/P22细胞的裸鼠肿瘤组织有较好的HBV/P22蛋白表达，两对照组均为阴性（图4）。
2. 流式细胞仪检测细胞凋亡情况：各组细胞经TNFα刺激6h后，HepG2-pcDNA3.1+HBV/P22细胞（实验组）凋亡率明显低于HepG2细胞（空白对照组）和HepG2-pcDNA3.1+细胞（阴性对照组），P值均<0.05 (表1) （略） 。
3. 细胞TUNEL测定：HepG2细胞和HepG2- pcDNA3.1+细胞组均可见大量凋亡细胞，细胞核呈棕黄色。HepG2-pcDNA3.1+HBV/P22细胞组细胞凋亡率明显低于其他两组，P值均<0.05（表1，图5A略）。
表1 （略）
4. 肝癌肿瘤组织细胞TUNEL测定：瘤体组织经TUNEL测定后证实HepG2-pcDNA3.1+HBV/P22细胞的瘤体组织细胞凋亡率（16.73%±1.52%）明显低于HepG2-pcDNA3.1+细胞凋亡率（28.42%±1.79%）与HepG2 细胞凋亡率（47.75%±2.88%），P值均<0.05（图5B、5C、5D）。
讨 论
长期以来，人们认为前C/C区蛋白对细胞没有生物调控作用，近几年的研究发现C区基因编码的HBcAg可以调控细胞内的基因表达。它能反式抑制干扰素β基因转录，从而抑制细胞内IFN蛋白的表达[3]；它能反式抑制MXA基因启动子活性[4]。在我们前期研究中，刘定燮[5]构建HBcAg表达载体并筛选HepG2细胞克隆株，研究表明HBcAg具有抑制Fas 抗体及干扰素α诱导的HepG2细胞凋亡的作用。HBV/P22蛋白含有HBcAg的全部氨基酸序列，因此该蛋白也可能参与抑制细胞凋亡的过程。TNFα在体内主要存在于肝脏中，它是导致重型肝炎发病的核心细胞因子之一，但体外研究表明，TNFα诱导肝细胞凋亡需要某些因素协同作用[6-8]，即TNFα诱发细胞凋亡需要其他因素在转录水平进行阻遏。Act D是一种RNA合成抑制剂，Act D处理后，肝癌细胞对TNFα的刺激变得敏感，从而导致凋亡。本研究体外实验中，流式细胞仪和TUNEL检测显示表达HBV/P22蛋白的HepG2细胞经TNFα刺激后凋亡率明显低于HepG2细胞和含空质粒载体的HepG2细胞，说明HBV/P22蛋白能抑制诱导的HepG2细胞凋亡；体内实验将三组细胞分别注射入裸鼠体内，瘤体组织TUNEL检测结果表明，表达HBV/P22蛋白的瘤体中细胞凋亡率明显低于另外两组，这一结果进一步证实HBV/P22蛋白可抑制诱导的HepG2细胞凋亡。
有报道HBV/P22蛋白的23～73位氨基酸部分与Fas死亡结合蛋白的死亡效应区有23.5%的同源性[9]，Fas死亡结合蛋白是TNFα诱导细胞凋亡的重要通路蛋白[10]，因此HBV/P22蛋白可能通过影响Fas-Fas配体介导的凋亡途径，从而抑制TNFα诱导的细胞凋亡。HBV/P22蛋白抑制凋亡的效应，可能在HBV感染导致的肝癌发生发展过程中起一定的作用。
参 考 文 献
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