【摘要】 目的 探讨乙型肝炎病毒HBx蛋白对阿霉素诱导的肝癌细胞凋亡的影响。 方法 将adr亚型HBx基因片段定向插入绿色荧光蛋白（GFP）真核表达载体pEGFP-C1，构建重组体pGFP-HBx。将pEGFP-C1、pGFP-HBx转染HepG2细胞，采用G418筛选抗性克隆、荧光显微镜观察及RT-PCR检测HBx基因表达情况以建立稳定表达细胞株HepG2/GFP、HepG2/GFP-HBx。用阿霉素（2.5μg/ml）分别处理HepG2、HepG2/GFP、HepG2/GFP-HBx细胞，处理后不同时间在显微镜下观察细胞形态变化，并用锥虫蓝染色计数死亡细胞；流式细胞仪检测阿霉素处理36h后细胞凋亡率。 结果 HepG2/GFP、HepG2/GFP-HBx细胞传70代后，仍表达强的GFP；RT-PCR检测显示在HepG2/GFP-HBx细胞有HBx基因转录表达。锥虫蓝染色检测表明阿霉素处理的HepG2、HepG2/GFP细胞发生了明显的时间依赖性细胞死亡，而在HepG2/GFP-HBx和对照组细胞未见明显细胞死亡；流式细胞仪检测显示阿霉素处理36h后，HepG2/GFP-HBx细胞凋亡率为3.94%，明显低于HepG2（59.03%）、HepG2/GFP细胞（61.38%）(P<0.01)，而与未处理对照组细胞凋亡率（2.12%，2.78%，2.55%）差异无统计学意义 (P>0.05)。 结论 成功建立了稳定表达GFP、GFP-HBx的HepG2细胞株；HBx能够抑制阿霉素诱导的HepG2细胞凋亡。 【关键词】 癌，肝细胞； 细胞凋亡； HBx蛋白，肝炎病毒，乙型； 阿霉素； 绿色荧光蛋白 Hepatitis B virus X protein suppressing adriamycin-induced apoptosis of HepG2 cells FAN Hong-mei, YANG Lin, XIE Qi-feng, HAN Xiao-yan, WU Meng, ZHANG Fu-cheng, YAO Chun-lan, LI Gang, GAO Zhi-liang. Department of Infectious Diseases, Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Key Laboratory of Hepatology of Guangdong Province, Guangzhou 510630, China Corresponding author: YANG Lin, Email:linyang1962@ 163.com 【Abstract】 Objective To investigate the effect of hepatitis B virus X protein (HBx) on adriamycin-induced apoptosis of hepatocellular carcinoma cells. Methods HBx gene fragment was amplified from subtype adr HBV plasmid by PCR, and inserted into Hind III and Kpn I sites of green fluorescent protein (GFP) eukaryotic expression vector pEGFP-C1 to construct recombinant pGFP/HBx. The pEGFP-C1 and pGFP-HBx were introduced into HepG2 cells by Lipofectamine 2000 to obtain HepG2 cells expressing GFP. GFP-HBx fusion protein was selected using G418. The expression of HBx gene was demonstrated by RT-PCR analysis. HepG2, HepG2/GFP and HepG2/GFP-HBx cells were treated with adriamycin (2.5μg/ml), and apoptosis of the cells was determined by their morphological changes, trypan blue exclusion, and flow cytometry analysis. Results Under a fluorescence microscope, visible expression of GFP and GFP-HBx fusion proteins were observed in HepG2/GFP and HepG2/GFP-HBx cells, even after growing over 70 generations. RT-PCR analysis showed that HBx gene was expressed in HepG2/GFP-HBx cells. Trypan blue exclusion showed adriamycin induced time-dependent cell death in HepG2 and HepG2/GFP cells while no significant cell death was observed in HepG2/GFP-HBx cells. Flow cytometry analysis showed that apoptosis rates in HepG2/GFP-HBx (3.94%) cells were significantly lower than those in HepG2 (59.03%) and HepG2/GFP cells (61.38%) at 36 hours after the adriamycin treatment (P < 0.01). No significant differences of apoptosis rates of HepG2/GFP-HBx (3.94%) and of the untreated cells (2.12%, 2.78%, 2.55%) (P > 0.05) were observed. Conclusions A HepG2 cell line expressing GFP and GFP-HBx fusion proteins was successfully established. HBV X protein blocks adriamycin-induced apoptosis of these HepG2 cells. 【Key words】 Carcinoma, hepatocellular; Apoptosis; HBx protein, hepatitis B virus; Adriamycin; Green fluorescent protein HBx基因编码的X蛋白（hepatitis B virus X protein, HBx蛋白）具有广泛的基因转录调控作用，并能与宿主细胞的多种蛋白质相互作用，从而影响病毒自身的复制、细胞增殖与分化、细胞凋亡等重要过程[1，2]，HBx蛋白的这些功能可能与HBV相关性肝癌的发生发展有关，但其具体机制尚不清楚。细胞凋亡对维持机体自身的稳定性和防御肿瘤的发生有重要作用，它的紊乱参与了多种疾病和肿瘤的发生。阿霉素是临床上常用的抗肿瘤药物之一，能诱导细胞DNA损伤和干扰DNA代谢而促进肿瘤细胞凋亡[3]，但肝癌细胞常对阿霉素产生耐药性。为探讨HBx蛋白对细胞凋亡的调控、在HBV相关肝癌发生及肝癌细胞耐药中的作用与机制，我们分别建立了稳定表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）、GFP-HBx融合蛋白的HepG2/GFP、HepG2/GFP-HBx细胞株，并系统地研究了HBx对阿霉素诱导的细胞凋亡的影响。 材料与方法 1. 质粒与细胞：HBV质粒 pHBV (adr亚型)、大肠杆菌DH5α及人肝母瘤细胞株HepG2细胞均为广东省肝脏疾病研究重点实验室保存，GFP真核表达载体pEGFP-C1购自美国Bio-Tech公司。 2. 主要试剂：阿霉素购自美国Sigma公司。Annexin Ⅴ-碘化丙啶凋亡检测试剂盒购自美国BD Bioscience公司。限制性内切酶HindⅢ和KpnⅠ、T4 DNA连接酶、G418购自美国Promega公司，Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker（DL2000、DL15000）购自大连宝生物工程有限公司，DNA片段纯化及质粒抽提试剂盒购自德国Qiagen公司。DMEM培养基、新生牛血清、脂质体转染试剂盒LipofectamineTM 2000、Trizol试剂盒均购自美国Invitrogen公司。逆转录试剂盒购自加拿大Fermentas生命科学公司。 3. 重组体构建及稳定表达细胞株的建立：根据adr亚型HBV基因序列[4]自行设计HBx基因的PCR引物（下同），引物1（HBV DNA nt1371～1391）：5′-GCTCAAGCTTCCCATGGCTGCTCGG GTGT-3′；引物2（HBV DNA nt1828～1846）：5′-CACGGGTACCAGATGATTTAGGCA GAGGTG-3′ (划线处分别为HindⅢ、KpnⅠ内切酶的酶切位点），引物由上海英骏公司合成。PCR法从adr亚型HBV质粒扩增HBx基因片段并定向插入pEGFP-C1的HindⅢ、KpnⅠ酶切位点以构建重组体pGFP-HBx。对酶切鉴定的重组体pGFP-HBx进行部分基因测序确证。HepG2细胞用含体积分数10%新生牛血清的DMEM，在5% CO2、37℃条件下培养。按LipofectamineTM 2000试剂盒说明书方法,将pEGFP-C1、pGFP-HBx分别转染HepG2细胞，转染后36h按1∶5比例传代细胞，加G418选择抗性细胞克隆，挑取带绿色荧光的抗性细胞克隆扩大培养以建立稳定表达细胞株HepG2/GFP、HepG2/GFP-HBx。收集HepG2、HepG2/GFP、HepG2/GFP-HBx细胞，提取细胞总RNA，采用RT-PCR检测转染细胞中HBx基因表达，上游引物：5′-ATGGCTGCTCGGGTGTGCTG-3′，下游引物：5′-AGTTGCATGGTGCTGGTG-3′。用3-磷酸甘油醛脱氢酶作为RT-PCR内对照，上游引物：5′-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物：5′-GACCACCTGGTGCTCAGTGT-3′，拟扩增产物大小分别为430bp和840bp。引物由上海英骏公司合成。RT-PCR操作按试剂盒说明书进行。 4. 锥虫蓝染色计数凋亡性死亡细胞数：取对数生长期HepG2、HepG2/GFP、HepG2/GFP-HBx细胞，按2.5×106个/皿接种至60mm培养皿，培养24h，加入阿霉素（2.5μg/ml）继续培养并观察记录细胞的形态变化；锥虫蓝染色计数阿霉素处理后12、24、36、48、60h各组细胞的凋亡性死亡细胞数。 5. 流式细胞仪检测细胞凋亡：细胞培养及处理同前。收集对照组和阿霉素处理后36h的各细胞，用预冷磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次，1000r/min离心5min，弃上清液，收集细胞沉淀，用Annexin Ⅴ-碘化丙啶染色及流式细胞仪检测、分析细胞凋亡情况，具体方法按细胞凋亡检测试剂盒说明书进行。 6. 统计学分析：数据用SPSS10.0统计软件进行t检验。 结 果 1. 重组体构建及稳定表达GFP、GFP-HBx细胞株的建立：琼脂糖电泳表明成功扩增、获得了与预期结果相符（480bp大小）的HBx基因片段（图1）。将HBx基因插入pEGFP-C1后的阳性克隆DNA经HindⅢ与KpnⅠ双酶切鉴定，表明成功构建了重组体pGFP-HBx（图2），经部分测序分析，重组体各连接位点及阅读框架正确。将pEGFP-C1及pGFP-HBx分别转染HepG2细胞后经G418筛选及抗性克隆的扩大培养，获得了表达GFP、GFP-HBx的细胞，分别传代70次后细胞仍表达较强的绿色荧光。在普通光与荧光显微镜下比较观察显示，每个细胞均表达GFP（图3）。RT-PCR分析显示，在HepG2/GFP-HBx细胞中，扩增出大小与预计相符的基因片段（图4），而HepG2、HepG2/GFP细胞未见相应条带，表明HepG2/GFP-HBx细胞有HBx基因转录、表达。以上结果表明成功建立了纯的稳定表达GFP、GFP-HBx的细胞株HepG2/GFP、HepG2/GFP-HBx，为下一步实验提供了基础。 2. HBx对阿霉素诱导的HepG2细胞凋亡有抑制作用：阿霉素处理的HepG2、HepG2/GFP细胞出现明显的凋亡性细胞死亡，表现为细胞形态变圆、皱缩、脱落。锥虫蓝染色计数细胞死亡结果显示，HepG2、HepG2/GFP细胞在处理后24h即出现细胞死亡，并随着阿霉素处理时间的延长而逐渐增加，在处理后60h，死亡率分别达68%、74%，而HepG2/GFP-HBx细胞仅为5%；未处理的对照组HepG2、HepG2/GFP、HepG2/GFP-HBx未见明显的细胞死亡，其死亡率分别为6%、5%、7%（图5，6）。为进一步确定细胞的凋亡性死亡率， 进行了流式细胞仪检测，结果显示，阿霉素处理36h后HepG2、HepG2/GFP细胞的凋亡率分别为59.03%、61.38%，而HepG2/GFP-HBx细胞的凋亡率仅为3.94%。HepG2/GFP-HBx细胞的凋亡率明显低于处理后的HepG2、HepG2/GFP细胞（P<0.01），而与未处理对照组的HepG2、HepG2/GFP、HepG2/GFP-HBx细胞凋亡率（2.12%、2.78%、2.55%）差异无统计学意义(P>0.05)。上述结果表明HBx蛋白能抑制甚至阻断阿霉素诱导的HepG2细胞凋亡。 讨 论 HBx蛋白可能致肝细胞癌的机制尚不太清楚。由于HBx蛋白在HBV感染者体内表达水平较低，难以检测，从临床材料的途径研究HBx蛋白作用有较大困难。外源目的蛋白与荧光蛋白的融合表达具有检测方便及利于研究目的蛋白的细胞定位等优点，因此，本研究将HBx基因插入绿色荧光蛋白表达载体GFP编码序列的3′端，构建了GFP与HBx蛋白的重组体，并转染HepG2细胞建立了稳定表达GFP、GFP-HBx融合蛋白的HepG2/GFP、HepG2/GFP-HBx细胞株。实验结果表明，所获得的HepG2/GFP、HepG2/GFP-HBx细胞，经传70代后，仍表达强的荧光。RT-PCR方法检测表明，转染pGFP-HBx的HepG2/GFP-HBx细胞有HBx基因转录表达。该细胞株的建立为研究HBx蛋白在肝细胞损伤及肝细胞癌变中的作用建立了研究平台。 细胞凋亡被抑制则可能与细胞肿瘤的发生有关。阿霉素发挥作用的主要机制是诱导肿瘤细胞DNA损伤和干扰DNA的代谢，从而促进肿瘤细胞凋亡。文献报道肝癌等肿瘤常对阿霉素产生耐药性，其原因可能与阿霉素诱导的细胞凋亡被抑制有关[3]，因此，以阿霉素诱导肝癌细胞凋亡为实验系统，研究HBx蛋白对阿霉素诱导的肝癌细胞凋亡的影响是阐明HBx蛋白在肝癌发生中的作用及机制的重要手段，同时，也是研究HBV相关肝癌细胞对阿霉素耐药机制的重要线索。本研究结果表明，HBx蛋白抑制甚至阻断了阿霉素诱导的人肝母瘤细胞HepG2的凋亡。目前鲜见HBx蛋白调控抗癌药物阿霉素诱导的肝癌细胞凋亡的报道，该结果提示HBx蛋白不但在肝癌发生中起作用，并可能在HBV相关肝癌的发展、HBV相关肝癌耐药发生中也起一定作用。 HBx基因对细胞凋亡的影响较复杂，可因实验细胞类型、干预因素、HBx蛋白水平等因素不同而表现出抑制或促进细胞凋亡的两种不同作用[5，6]。我们的研究结果表明HBx蛋白抑制了阿霉素诱导的细胞凋亡，但其机制尚不清楚。由于阿霉素诱导的细胞凋亡与p53通路有关，而有文献报道HBx蛋白具有抑制p53通路的功能[7]。HBx蛋白是否通过对p53通路功能的影响而抑制、阻断阿霉素诱导的细胞凋亡尚不清楚，值得进一步研究。本研究仅是我们初步研究结果的报道，我们将以此进一步研究HBx蛋白抑制阿霉素诱导细胞凋亡的机制及在肝细胞癌变中的作用与分子机制。 参 考 文 献 [1]Tang H, Delgermaa L, Huang F, et al. 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