【关键词】 瘦素； 肝星状细胞； Ⅰ型胶原； 基质金属蛋白酶组织抑制因子1
Effects of rat recombinant leptin on gene expression of collagen I and tissue inhibitor of metalloproteinase 1 in HSC-T6 cells WANG Li-ting, MA Hong, ZHANG Peng, JIA Ji-dong.
【Key words】 Leptin; Hepatic stellate cells; Collagen, type I; Tissue inhibitor of metalloproteinase 1
【First author's address】 Liver Research Center, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050, China
Corresponding author: MA Hong, Email: mahongmd@ yahoo.com.cn
瘦素是由肥胖基因所编码的一种由167个氨基酸组成的分泌型蛋白质[1]。生理状态下瘦素是维持体重和能量平衡的重要调节物质。近年研究发现，瘦素与慢性肝病及肝纤维化的关系密切[2]。本研究采用逆转录PCR及细胞免疫组织化学的方法，观察HSC-T6是否表达瘦素和瘦素的功能性受体(OB-RL)，并观察不同浓度的外源性鼠重组瘦素对HSC-T6细胞Ⅰ型胶原、TIMP1 mRNA表达的影响，以进一步了解瘦素致纤维化的机制。
一、材料与方法
1. 鼠重组瘦素的制备：用0.5ml 15mmol/L HCl和0.3ml 7.5mmol/L NaOH溶解鼠重组瘦素，浓度为1.25mg/ml。分别稀释为100、500、1000、1500ng/ml等不同的工作液浓度，0.22μm的滤器滤过。
2. 细胞系: 肝星状细胞系HSC-T6由美国纽约西奈山医学院肝病科Friedman教授惠赠，系SV40转染SD大鼠肝星状细胞而成，其表型为活化的HSC，表达高水平的I型胶原、TIMP1等[3]。
3．CCl4肝纤维化模型的制备：雄性Wistar大鼠（中国医学科学院实验动物中心提供）随机分为两组：正常组给予橄榄油溶液3ml/kg皮下注射，每周2次，共8周；模型组首剂按5ml/kg给予40% CCl4橄榄油溶液皮下注射，以后按3ml/kg体重给予，每周2次，共8周。每周称重1次，根据体重调整药物用量。所有动物饲养于12h光照，40%左右相对湿度的普通设施中，自由饮食及饮水。
4. 主要试剂与仪器: DMSO为北京昌化经销化工厂产品。DMEM/IMDM培养液，胎牛血清为美国Gibco公司产品。鼠重组瘦素，MTT为美国Sigma公司产品。总RNA提取试剂盒、MMV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Oligo(dT)15 Primers、Taq酶、PCR分子量标准、琼脂糖均为美国Promega公司产品。Forma CO2培养箱，日本岛津UV-1206紫外分光光度计，奥地利SLTLAB INSTRUMENT酶标仪，日本Olympus倒置显微镜，美国Bio Rad公司Gene Cycler，Bio Rad公司凝胶成像系统、Eppendorf高速低温离心机，Bio-Rad电泳仪。
5. 检测方法：（1）MTT法观察瘦素对HSC-T6细胞生长的影响；选择细胞存活率大于90%的瘦素浓度用于实验。（2）RT-PCR观察HSC-T6细胞及正常肝组织、肝纤维化模型组织中瘦素、瘦素功能性受体的表达及外源性鼠重组瘦素对HSC-T6细胞Ⅰ型胶原、TIMP1 mRNA表达的影响：造模8周后处死动物，1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，取出肝脏，经冷等渗盐水灌注冲洗残血后，将肝脏迅速置液氮冻存备用。用TRIzol一步法提取肝组织中总RNA，采用紫外分光光度法测定提取的总RNA含量及纯度。以鼠肝癌7402细胞作为瘦素及瘦素受体的阴性对照。（2）对复苏后处于对数生长期的HSC-T6细胞，0.25%胰酶消化，含10% FCS的DMEM/IMDM培养液均匀种于200ml培养瓶中，培养48h后，弃去上清液，分别加入鼠重组瘦素浓度分别为100、500、1000、1500ng/ml的无血清培养液10ml，4瓶重复，空白对照组不加鼠重组瘦素,其他条件完全相同。培养48h后，弃去上清液，以细胞刷取细胞，应用TRIzol试剂盒提取细胞总RNA，采用紫外分光光度法测定提取的总RNA含量及纯度。（3）以GAPDH为内参照，采用RT-PCR法[4]检测Ⅰ型胶原、TIMP1 mRNA的表达情况。Leptin、OB-RL、COL-1、TIMP1、GAPDH的引物序列如下：leptin上游引物为5′-GTTCAAGCTGTGCCTATCC-3′，下游为5′-AGAAT GTCCTGCAGAGAGC-3′(419bp)；OB-RL上游引物为5′-TGGATGAAAGGGGACTTGAC-3′，下游为5′-TCCTG AGCCATCCAGTCTCT-3′(552bp)；Ⅰ型胶原上游引物为5′-GGTTTGGAGA GAGCATGACC-3′，下游为5′-TTTGGGGAAATTGAGTTTGG-3′(514bp)；TIMP1上游引物为5′-CATGGAGAGCCTCTGTGGAT-3′，下游为5′-GTTCAGGCTTCAGCTTTTGC-3′(393bp)；GAPDH上游引物为5′-CCCTTCATTGACCTCAACTACATGG-3′，下游为5′-CATGGTGGTGAAGACGCCAG-3′(209bp)。PCR反应参数为：94℃预变性2min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸50s；35个循环；72℃后延伸7min。PCR产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像系统照相，并用Quantity one软件计算COL-1、TIMP1基因相对表达值。Ⅰ型胶原基因相对表达值=(Ⅰ型胶原基因条带面积×条带灰度)/ (GAPDH基因条带面积×条带灰度)。同法计算TIMP1基因相对表达水平。（4）免疫细胞化学染色检测瘦素及瘦素受体的表达。
6．统计学处理：实验结果数据以x-±s表示，应用SPSS11.5统计软件，单因素方差分析(Oneway ANOVA) 进行统计学处理。
二、结果
1．不同浓度瘦素对HSC-T6细胞生长的影响：MTT实验结果表明，不加瘦素的对照组（0ng/ml）、100、500、1000、1500ng/ml浓度瘦素组作用于HSC-T6细胞48h后的A值分别为0.384±0.241，0.391±0.139，0.365±0.282，0.365±0.282，0.382±0.431，0.428±0.317，组间F＝3.612，P＜0.05，差异有统计学意义。其中1500ng/ml浓度瘦素组明显促进了HSC-T6细胞生长，而其他组间差异不大。各组HSC-T6细胞的存活率均在90%以上，对其生长无抑制作用。
2. RT-PCR结果：HSC-T6细胞和肝纤维化组织均表达瘦素和瘦素功能性受体mRNA；正常肝组织不表达瘦素mRNA，只表达瘦素功能性受体mRNA，而在作为阴性对照的鼠肝癌7402细胞中则既无瘦素也无瘦素功能性受体的表达。
3. 细胞免疫组织化学结果：瘦素主要定位于细胞质，瘦素受体定位于细胞质和细胞膜上。
4. 外源性鼠重组瘦素对HSC-T6细胞Ⅰ型胶原、TIMP1 mRNA水平的影响：不同浓度的外源性鼠重组瘦素100、500、1000、1500ng/ml作用于HSC-T6细胞48h后，Ⅰ型胶原mRNA水平升高，组间比较，F＝9.83，P＜0.01，差异有统计学意义。其中500、1000、1500ng/ml组与空白对照组比较，P＜0.05，差异有统计学意义。且随瘦素浓度增加，Ⅰ型胶原 mRNA水平逐渐升高，1000、1500ng/ml组与空白对照组比较，P＜0.01，差异有统计学意义，并呈剂量依赖性关系；TIMP1 mRNA水平，组间F＝0.171，P＞0.05，差异无统计学意义。结果见表1。
表1 （略）
三、讨论
随着研究的不断深入，人们逐步认识到瘦素在肝纤维化形成中的作用，但有关瘦素功能性型受体的表达及其作用机制等问题仍存在两种不同观点：一种观点认为激活的HSC表达瘦素和瘦素功能性受体OB-RL，瘦素作为一个独立的致纤维化因子，使HSC胶原基因的表达增加[5]；另一种认为HSC中不表达功能性受体，瘦素通过作用于窦内皮细胞上的功能性瘦素受体，增加了TGFβ1的分泌，进而促进HSC合成胶原[6]。
本研究结果显示HSC-T6细胞表达瘦素功能性受体，进一步研究发现，外源性鼠重组瘦素可促进HSC-T6细胞Ⅰ型胶原mRNA的表达，呈剂量依赖性，说明瘦素可能通过自分泌途径，作用于HSC-T6细胞的瘦素受体，促进胶原的合成，从而促进肝纤维化的发展。
TIMP1是抑制MMP活性的一组多功能因子家族的主要成员之一，能结合除MMP14、19以外的所有MMP而使其活性减弱，是肝纤维化发生过程中的一个非常重要的促发因素[7]。TIMP1的主要细胞来源是激活的HSC，它不是肝纤维化的始发因素, 但在肝纤维化的发展过程中起重要的促进作用。目前国内外有关瘦素致肝纤维化机制的研究多集中于瘦素对胶原合成的影响，尚鲜见其对胶原降解作用的报道。本实验在研究瘦素对Ⅰ型胶原合成作用的同时，进一步观察瘦素对TIMP1的影响。结果表明，不同浓度的瘦素对TIMP1 mRNA的合成无明显影响，但其是否通过抑制MMP的表达和活性而对胶原降解产生作用，还需进一步研究证实。
参 考 文 献
[1]Anania FA. Leptin, liver, and obese mice--fibrosis in the fat lane. Hepatology, 2002, 36: 246-248.
[2]Testa R, Franceschini R, Giannini E, et al. Serum leptin in levels in patients with viral chronic hepatitis or liver cirrhosis. J Hepatol, 2000, 33: 33-37.
[3]Friedman SL, Lalazar A, Crong L, et al. HSC-T6 cells, an immortalized rat hepatic stellate cell line. Hepatology, 1997, 26(4Pt): 338A.
[4]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning (2). 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989: 14.
[5]Saxena NK, Saliba G, Floyd JJ, et al. Leptin induces increased alpha2(I) collagen gene expression in cultured rat hepatic stellate cells. J Cell Biochem, 2003, 89: 311-320.
[6]Ikejima K, Takei Y, Honda H, et al. Leptin receptor-mediated signaling regulates hepatic profibrogenic and remodeling of extracelluar matrix in the rat. Gastroenterology, 2002, 122: 1399-1410.
[7]Yin CH, Ma H, Wang AM, et al. Effect of compound 86l on tissue inhibitor of metalloprotenase l gene expression of HSC-T6 cells. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2002, 10: 197-199.
阴赪宏,马红,王爱民,等.复方861对HSC-T6细胞组织基质金属蛋白酶抑制因子1基因表达的影响.中华肝脏病杂志,2002,10:197-199. 《中华肝脏病杂志》版权 |
