【摘要】目的研究血管内皮细胞生长因子（VEGF）对肝癌HepG2细胞同质性粘附作用和钙粘附蛋白（E-cadherin）的影响。方法采用3H-TdR掺入试验测定VEGF对肝癌HepG2细胞同质性粘附作用，激光扫描共聚焦显微镜检测VEGF对肝癌细胞E-cadherin表达作用 。结果1 ng/ml、5 ng/ml VEGF诱导HepG2细胞60 min、90 min3H-TdR掺入实验（dpm/min）分别为1 758.67±289.46、1 380.03±328.55和3 124.3±2 262.14、2 245.6±273.24，10 ng/ml VEGF诱导HepG2细胞60 min、90 min、120 min3H-TdR掺入实验分别为1 232.32±201.04、2 337.5±333.04、2 236.99±237.07，显著低于对照组60、90、120分钟的2 184.49±336.03、3 560.±255.17和4 337.4±377.35。5 ng/ml VEGF降低肝癌细胞E-cadherin的表达，荧光强度为757±103，显著低于对照组的352±56。结论VEGF降低肝癌细胞同质性粘附作用可能与其降低肝癌细胞E-cadherin有关。 【关键词】血管内皮细胞生长因子； 肝癌细胞株； 钙粘附蛋白 Effects of VEGF on the expression of homotypic adhesion and E-cadherin of HepG2 cells MAO Hua, ZHAO Minfang, SONG Weisheng.The Institute of Digestive Department of Nanfang Hospital, First Milityry Medical University, Guang zhou 510515, China 【Abstract】ObjectiveTo study the effects of vascular endothelial growth factor (VEGF） on the expression of homotypic adhesion and E-cadherin of hepatocellular carcinoma cells.MethodsWe measured the function of homotypic adhesion with3H-TdR incorporation and expression of E-cadherin with Laser Scanning Confocal Microscope.ResultsAfter 60，90 min,the value (dpm/min) of3H-TdR incorporated in HepG2 cells induced by 1 ng/ml and 5 ng/ml VEGF were 1 758.67±289.46,1 380.03±328.55 and 3 124.3±2 262.14,2 245.6±273.24， 10 ng/ml VEGF were 1 232.32±201.04,2 337.5±333.04 and 2 236.99±237.07，which is lower than that in contral group.The expression of E-cadherin in hepatocellular carcinoma cells induced by 5 ng/ml VEGF is 757±103 which is much lower than that in contral group of 352±56.ConclusionVEGF can decrease homotypic adhesion of hepatocellular cancinoma cell HepG2,which is connected with fewer expression of E-cadherin in hepatocellular cancinoma cell HepG2 induced by VEGF. 【Key words】Vascular endothelial growth factor; Hepatocellular carcinoma cell lines; E-cadherin 血管内皮细胞生长因子（VEGF）是重要的血管形成因子，可诱导肿瘤血管形成， 与肿瘤浸润和转移密切相关［1］。粘附是肿瘤转移过程中的重要环节。为研究VEGF是否影响肿瘤细胞粘附作用，本研究采用激光扫描共聚焦测定VEGF诱导肝癌细胞后，对钙粘附素（E-Cadnine）表达的作用和肝癌细胞同质性粘附作用的影响。 材料与方法 一、材料 肝癌HepG2 细胞株由第一军医大学南方医院全军消化疾病研究所实验中心提供，RPMI—1640购自Sigma公司，小牛血清购自杭州四季青公司。VEGF为美国Pepro Tech公司产品，用无血清RPMI—1640培养液配制成10 ng/μl,置于-20°C保存待用。E-Cadnine 鼠抗人IgG、FITC标记的羊抗鼠二抗购自博士德生物工程公司。 二、方法 96孔板中加入培养的HepG2细胞 （105/ml），每孔100 μl，置于37°C、5％CO2培养，待培养孔底层细胞长满单层不留空隙为标准。在HT-29细胞生长旺盛时加入含3H-TdR（5 μCi/ml）的新鲜RPMI-1640培养液标记18～24 h后，然后以无钙镁PBS或Hank’s液洗涤数次，0.25%胰蛋白酶消化制备细胞悬液，调整细胞浓度为105/ml。然后将标记的细胞悬液100 μl加到单层培养的靶细胞表面，设置空白、全部加入标记肿瘤细胞对照组和VEGF 1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml浓度组，分别培养60、90、120 min，每组设3个复孔，取平均值。培养结束后，弃去培养液，用PBS缓冲液100 μl洗涤数次，多头细胞收集仪收集96孔板底部的细胞至醋酸纤维滤纸上，烤干后置于闪烁液中，BACKMANL600型液闪仪进行液闪计数，测定脉冲数cpm（dpm/min）。 消化培养的HepG2细胞（105/ml）100 μl置于细胞培养皿中央，置于37°C、5％CO2培养6～8 h,待细胞铺满整个皿底后，对照组加入5 μl 10％牛血清白蛋白（BSA），另一组加入VEGF，使终浓度为5 ng/ml ，继续培养120 min。培养结束后，用PBS洗涤2遍。1％多聚甲醛固定细胞30 min，PBS洗涤3遍，每次5 min。0.5%小牛血清100 μl覆盖细胞10 min，去除内源性非特异性蛋白，PBS轻洗2次。加入鼠抗人E-Cadnine IgG一抗（0.5～1 μg/ml）,置于湿盒中，室温下孵育60 min。PBS洗去一抗，加入FITC标记羊抗鼠二抗，室温下暗处孵育30 min后，上机检测。 采用美国ＭＥＲＩＤＩＡＮ 公司生产的ＡＣＡＳ ＵＬＴＩＭＡ３１２型激光共聚焦显微镜（ＣＯＮＦＯＣＡＬ）。激光光源：１２Ｗ氩离子激光，输出紫外光和可见光波长。 激光波长为４８８ nm， 扫描方式为快速镜扫描，精度０．4 μｍ，扫描速度１２０幅／秒,像素最小距离０．１ μｍ，激光点最小０．１ μｍ。样品置于倒置荧光显微镜（Olympus公司产品）下，物镜用100×油镜观察。计算每个样品100个细胞的平均荧光值。 三、统计学处理 采用多组间计数资料比较的F检验和两组间比较的t检验。 结果 1 ng/ml VEGF作用肝癌细胞120 min后同质性粘附作用显著降低(P<0.05);5 ng/ml、10 ng/ml VEGF作用肝癌细胞60、90 min后显著降低同质性粘附作用(P<0.05)，作用120 min后同质性粘附作用有非常显著性降低(P<0.01),见表1。 表1（略） 激光扫描共聚焦显微镜观察发现肝癌细胞表达的钙粘附素蛋白分布在细胞膜表面。对照组肝癌细胞荧光强度（见图1）较VEGF诱导2 h后肝癌荧光强度（见图2）更高，显示VEGF降低肝癌细胞钙粘附素的表达，与对照组比较(P<0.01),见表2。 图1（略）图2（略）表2（略） 讨论 恶性肿瘤的侵袭与转移行为是引起患者死亡的主要原因。癌转移是复杂的多步骤连续过程，包括肿瘤细胞从原发部位脱落、肿瘤细胞溶解组织基质后移动、肿瘤细胞与血管内皮细胞粘附、肿瘤细胞穿透血管壁、肿瘤细胞在血管内运行、转移灶的形成等过程。已有资料显示，癌转移与肿瘤细胞之间粘附能力降低以及瘤细胞和内皮细胞之间粘附能力增强有关。在动物的高浸润性肿瘤细胞株，其瘤细胞表面的粘附分子E（E-cadherin）表达和分泌减少，而将编码E-cadherin的DNA插入到肿瘤细胞基因组中，则肿瘤细胞丧失转移和浸润能力［2］。E-cadherin介导细胞间的粘附作用，高浸润性肿瘤细胞E-cadherin表达和分泌减少，使瘤细胞彼此分散才能侵入细胞外基质。肿瘤的生长可分为肿瘤细胞的克隆性增殖期（无血管期）和血管形成期［3］。当肿瘤组织生长在0.02～0.03 m以内时，肿瘤细胞数在107以内，肿瘤组织没有血管生成，肿瘤一般无转移倾向 。一旦新生毛细血管长进肿瘤组织，肿瘤组织中VEGF表达增加，血管生成增多，肿瘤转移倾向增高［4］。VEGF促使肿瘤组织血管生成是肿瘤生长和转移的形态学基础，是促进肿瘤转移的重要因素，它不仅为肿瘤细胞提供充足的营养，促进肿瘤细胞分裂、增殖，而且为转移的肿瘤细胞提供了通道。我们的研究表明，VEGF也能使肝癌细胞本身转移能力增强［5］，VEGF可以减少肝癌HepG2细胞E-cadherin的表达和分泌，细胞间同质性粘附作用降低，可导致恶性肿瘤细胞彼此间粘附及连接作用减弱，使肿瘤细胞从原发灶脱落，获得高转移的能力。 参考文献 1毛华，袁爱力.影响血管内皮细胞生长因子表达的调控因素.国外医学生理、病理与临床分册，1999，23∶321-323 . 2周信达， 刘银坤， 汤钊猷.上皮钙粘蛋白(E-cadherin)在高侵袭性肝细胞癌中的表达.中华消化杂志，1998，18：31-33. 3何振辉.肿瘤血管生成机制与抗肿瘤血管生成.国外医学临床生物化学与检验学分册，2004，25∶14-16. 4Tayahashi Y,Tucker SL,Kitadai Y，et al.Vessel counts and expression of vascular endothelial growth factor as prognostic factors in nodenegative colon cancer.Arch Suger,1997，132∶541-546. 5毛华，袁爱力，赵敏芳，等.p38MAPK信号通路特异性阻断剂SB203580抑制VEGF诱导肝癌转移的实验研究.中华消化杂志，2000，20∶12-14. 上海《肝脏》杂志社 |