鼠肝缺血再灌注后血浆胆红素升高的分子机制

【摘要】目的  探讨鼠肝缺血再灌注后血浆胆红素升高的分子机制。  方法  实验分为假手术组、70%的鼠肝缺血20min再灌注组和缺血35min再灌注组，研究时点为再灌注后的6h、1d、3d和5d。HE染色分析肝组织病理改变。常规生物化学方法检测血浆及缺血肝叶胆汁中胆红素含量的变化。RT-PCR检测肝组织多药耐药相关蛋白2（MRP2）的表达。免疫组织化学方法分析MRP2在肝细胞毛细胆管膜上的定位。结果  缺血20min组和35min组再灌注模型炎症反应轻，无肝细胞坏死的发生。与假手术组比较，缺血20min组血浆中胆红素含量的升高、胆汁中胆红素含量的下降发生于再灌注后的6h～1d；缺血35min组却持续至再灌注后的3～5d。RT-PCR发现，缺血20min组和缺血35min组MRP2 mRNA表达的明显下调仅发生于再灌注后的6h。免疫组织化学法发现缺血35min组MRP2在胞膜下呈“囊状”分布，在毛细胆管膜上的定位减少。 结论  MRP2在毛细胆管膜上的定位减少很可能是鼠肝缺血再灌注后血浆胆红素升高发生的分子机制。
【关键词】再灌注损伤； 胆红素； 多药耐药相关蛋白

The mechanism of the increase of plasma bilirubin after hepatic ischemia-reperfusion in rats   YU Qiu-yun, SHU Ming, DAI Jing-hua, MA Jian-bo, YU Yong, LIU Dong-hai. Clinical Research Laboratory, Ningbo No.2 Hospital, Ningbo 315010, China
Corresponding author: SHU Ming, Email: sm680602@ sohu.com
【Abstract】  Objective    To investigate the mechanism of plasma bilirubin level increase after hepatic ischemia-reperfusion in rats. Methods    Rats were divided into a sham operation group (A group), a 20min ischemia-reperfusion group (B group) and a 35min ischemia-reperfusion group (C group). Study time points were 6 hours and 1, 3, and 5 days after the reperfusion. Pathological changes in the livers were studied with histological slides stained with hematoxilin and eosin. Routine biochemistry methods were used to detect the bilirubin level of blood plasma and the bile drained from the ischemic hepatic lobes. RT-PCR was used to analyze the expression of the multidrug resistance-associated protein 2 (MRP2) and mRNA. Immunohistochemistry was used to analyze the localization of MRP2 in the canalicular membrane. Results    B and C groups showed a mild inflammatory reaction without hepatocyte necrosis. At 6 h and 1 day after reperfusion, there was a significant increase of the plasma bilirubin level and a decrease of the bilirubin level of the drained bile in B group. These changes lasted to the day 3 and day 5 in C group. MRP2 mRNA down-regulation was found at 6 h only in the B and C groups. No localization of MRP2 in the canalicular membrane was found but it appeared in 搗esicules  under the canalicular membrane in C group. Conclusions    Absence of MRP2 localization in the canalicular membrane could be the cause of the blood plasma bilirubin level increase after liver ischemia-reperfusion.
【Key words】Reperfusion injury;    Bilirubin;    Multidrug resistance-associated protein
各类肝门阻断手术和肝移植术后常伴有血浆胆红素含量的升高。本研究采用70%的鼠肝热缺血再灌注模型，以再灌注后肝细胞毛细胆管膜上多药耐药相关蛋白2（multidrug resistance-associated protein 2，MRP2）表达及定位的改变来探讨鼠肝缺血再灌注后血浆胆红素升高发生的分子机制。
材料与方法
一、材料
1. 实验动物：雄性SD大鼠104只，体重（250±30）g，上海西普尔必凯实验动物有限公司提供（合格证号：沪动合字152号）。
2．试剂：TBil、结合胆红素（CB）和ALT试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；Trizol购自美国Invitrogen公司；Taq酶、dNTP mix及逆转录试剂盒购自美国Promega公司；MRP2引物由上海生工生物工程公司合成；DNA相对分子质量标记D2000购自北京天为时代公司；硅烷玻片购自丹麦Dako公司、小鼠抗大鼠MRP2单克隆第一抗体购自美国Kamiya Biomedical公司，辣根过氧化酶标记的山羊抗小鼠第二抗体购自美国Sigma公司。
3. 主要仪器：超高速低温离心机购自美国Beck-man公司、病理切片机购自英国Shandon公司、光学显微镜购自日本Olympus公司、DU 640紫外分光光度计购自美国Beckman公司、电热恒温水温箱购自美国Polyscience公司、电动匀浆机购自马来西亚Kika Works公司、超净工作台购自香港Heal Force公司、RNA浓度测定仪购自德国Eppendorf Biophotometer公司、PCR热循环仪购自美国MJ Research公司、水平电泳仪购自美国Bio-Rad公司、紫光灯购自美国3UV Transilluminator公司、凝胶成像系统购自美国Uvp BioImaging公司。
二、方法
1．动物模型制作及分组：进腹后分离切断肝周韧带，解剖肝门。按大鼠肝分叶，用小号无损伤动脉夹选择性夹闭肝左、中叶肝动脉、门静脉，保留肝右叶、尾叶血流，避免门静脉系统淤血。阻断持续一定的时间后，开放动脉夹，恢复阻断肝叶的血供，制成70%的鼠肝热缺血再灌注模型。实验分3组：假手术组，进腹后仅解剖肝门，不阻断血管；缺血20min组；缺血35min组。各组分别于再灌注后6h、1d、3d和5d开腹（每时段各8只大鼠），选择性插管于肝左、中叶的肝总管收集胆汁，下腔静脉取血，同时切取肝左、中叶分别置4%甲醛、液氮中保存。另取SD大鼠8只，制成70%的热缺血60min再灌注模型，再灌注后1d切取肝左叶置4%甲醛中保存。
2． HE常规染色分析各组大鼠再灌注后肝组织病理改变。
3. 3组大鼠血浆中TBil、CB、ALT和胆汁中CB含量的检测按试剂盒操作说明书进行。
4. RT-PCR检测3组大鼠肝组织MRP2 mRNA的表达：Trizol抽提肝组织总RNA，用焦碳酸二乙酯处理水将RNA稀释至0.5g/L，逆转录试剂盒合成cDNA。MRP2上下游引物序列分别为5′-CCGC GTCAGCAATTTTGATA-3′和5′-TCGGACCCA AACAGGATGTT-3′，退火温度54℃，32个循环，扩增产物大小288bp。β-actin上、下游引物序列分别为5′-CCTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3′和5′-TCTTCATGGTGCTAGGAGCCA-3′，退火温度54℃，30个循环，扩增产物大小646bp。扩增产物在15g/L琼脂糖电泳中分离，凝胶成像系统拍照分析。
5．免疫组织化学染色分析3组大鼠MRP2蛋白在毛细胆管膜上的表达、定位：石蜡切片，脱蜡入水，PBS漂洗，0.3%的双氧水封闭内源性过氧化酶10min，PBS漂洗；滴加0.4%的胃蛋白酶液，37℃孵育30min，微波修复10min，2%的牛血清白蛋白抗原封闭；滴加小鼠抗大鼠MRP2单克隆第一抗体（1∶20），湿盒4℃过夜；滴加山羊抗小鼠第二抗体（1∶150），37℃孵育30min，PBS漂洗；DAB显色；苏木素复染，中性树脂封片；光学显微镜下观察，肝细胞质、膜呈棕黄色为阳性。
三、统计学处理
用SPSS11.0软件进行数据统计处理。计量资料数据以x-±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
结    果
1. 再灌注后各组大鼠肝组织病理改变：假手术组再灌注后各时段无异常；缺血20min组再灌注后肝组织呈轻度的炎症反应，肝细胞胞质疏松化，无肝细胞坏死，以再灌注后1d为甚，再灌注后5d恢复正常；缺血35min组再灌注后肝组织呈轻、中度的炎症反应，以再灌注后1d为甚，汇管区可见少量的中性粒细胞浸润，肝细胞胞质疏松、气球样变，无肝细胞坏死，上述改变于再灌注后5d明显改善；肝缺血60min再灌注后1d肝组织呈重度的炎症反应，汇管区可见较多的中性粒细胞浸润，肝细胞空泡状变，嗜酸性或点状坏死，见图1。   
2．再灌注后6h～5d血浆中TBil、CB、ALT和胆汁中CB含量的比较：与假手术组比较，缺血20min组血浆中TBil、CB、ALT含量的升高仅发生于再灌注后的6h～1d，而缺血35min组于上述指标的异常持续至再灌注后的3～5d；与假手术组比较，缺血20min组胆汁中CB含量的下降发生于再灌注后6h，缺血35min组却持续至再灌注后3d，见表1。
3. 3组大鼠肝组织MRP2 mRNA表达的比较：除再灌注后6h，缺血20min组和缺血35min组MRP2 mRNA表达强度弱于假手术组外，其余时段未见明显改变，见图2。
4. 3组大鼠肝组织MRP2蛋白表达、定位的比较：假手术组MRP2蛋白沿肝细胞毛细胆管膜上规则表达，显示出肝细胞的轮廓。缺血35min组再灌注后6h，MRP2蛋白染色稀疏、散乱，蛋白质表达减少，胞质内可见棕黄染色；再灌注后1～5d，未见MRP2表达的减少，在毛细胆管膜下可见多处着色“分芽状小囊泡”的聚集，随再灌注时间的延长而逐渐明显，以再灌注后5d为甚。缺血20min组无上述情况的发生，见图3。
讨    论
我们的实验中，缺血20min组血浆中TBil、CB、ALT含量的升高、胆汁中CB含量的下降发生于再灌注后的6h～1d；缺血35min组却持续至再灌注后的3～5d，说明缺血35min再灌注模型可诱导血浆胆红素含量较长时间的升高。再灌注后肝组织病理检查发现，缺血20min组和缺血35min组再灌注后肝组织呈轻、中度的炎症反应，以再灌注后1d为甚，但无肝细胞坏死的发生；而缺血60min组肝组织呈重度的炎症反应，肝细胞空泡状变，嗜酸性或点状坏死。为避免肝细胞的坏死对下步实验中肝细胞MRP2基因及其蛋白表达的潜在影响，我们选用缺血20min和35min再灌注组为实验组。
MRP2是特异性定位于肝细胞毛细胆管膜上一个重要的胆汁成分转运蛋白，由1545个氨基酸组成，位于10号染色体短臂24带，相对分子质量为1.9×105，属于三磷酸腺苷结合的盒式蛋白[1]。MRP2是胆红素葡萄糖醛酸酯排泌的主要转运蛋白，通过ATP的水解将胆红素逆浓度梯度泵入小胆管内。MRP2表达的缺失可引起胆汁分泌减少、高胆红素血症的发生，如人类的Dubin-Johnson综合征[2]。MRP2除了载运胆红素外，谷胱甘肽、葡萄醛酸盐、硫酸盐和细胞毒素也由其转运[3]。MRP2的异常表达在内毒素血症、胆道梗阻、原发性胆汁性肝硬化和药物性肝脏损害等内、外科疾病血浆胆红素升高的发生中起重要作用。内毒素血症时MRP2基因表达显著下调[4]；胆管结扎后MRP2表达下降，术后3d和7d分别为对照组的53%和27%[5]。
各类肝门阻断手术、肝移植术后常伴有血浆胆红素含量的升高。从临床角度出发，了解MRP2异常表达在缺血再灌注后血浆胆红素升高发生中的作用具有重要的理论意义。目前，有关肝缺血再灌注后MRP2表达改变的文献少有报道。我们的实验中，缺血20min组和缺血35min组MRP2 mRNA表达的减少仅发生于再灌注后的6h，尚可解释缺血20min组再灌注后血浆、胆汁中胆红素含量的异常改变；但值得注意的是，缺血35min组MRP2 mRNA及其蛋白质短时间的表达下调不能解释再灌注后6h～5d血浆和胆汁中胆红素的异常改变，说明MRP2表达的改变可能也存在着与缺血再灌注损伤相关的特异性调控方式，MRP2表达的下调并非是缺血再灌注后血浆胆红素升高的主要原因。
MRP2作为肝细胞毛细胆管膜上的转运蛋白，只有定位在毛细胆管膜上才能发挥其转运胆红素的功能[6，7]。为探讨肝缺血再灌注后血浆胆红素的升高是否由MRP2蛋白定位改变所导致，我们采用免疫组织化学染色来分析再灌注后MRP2蛋白的定位，发现假手术组MRP2蛋白沿肝细胞毛细胆管膜上规则表达，显示出肝细胞的轮廓；缺血35min组再灌注后6h，MRP2蛋白染色稀疏、散乱，蛋白质表达减少，胞质内可见棕黄染色；再灌注后1～5d，未见MRP2表达的减少，在毛细胆管膜下可见多处着色“分芽状小囊泡”的聚集，随再灌注时间的延长而逐渐明显，以再灌注后5d为甚；缺血20min组无上述情况的发生。再灌注后，MRP2在胞质内的散在分布以及在胞膜下呈“分芽状小囊泡”的积聚现象提示，缺血再灌注损伤诱导了MRP2从毛细胆管膜上脱落、异常定位于细胞质内，以致MRP2转运胆红素失能，造成缺血再灌注后血浆胆红素含量的升高；随着再灌注时间的延长，那些脱落于胞质内的MRP2逐渐重新聚集、形成“囊泡”状，等待或部分已和毛细胆管膜融合，重新归巢于毛细胆管膜上以发挥其转运胆红素的功能。
参  考  文  献
[1]van Kuijck MA, Kool M, Merkx GF, et al. Assignment of the canalicular multispecific organic anion transporter gene (CMOAT) to human chromosome 10q24 and mouse chromosome 19D2 by fluorescent in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet, 1997, 77: 285-287.
[2]Kartenbeck J, Leuschner U, Mayer R, et al. Absence of the canalicular isoform of the MRP gene-encoded conjugate export pump from the hepatocytes in Dubin-Johnson syndrome. Hepatology, 1996, 23: 1061-1066.
[3]Fickert P, Zollner G, Fuchsbichler A, et al. Effects of ursodeoxycholic and cholic acid feeding on hepatocellular transporter expression in mouse liver. Gastroenterology, 2001, 121: 170-183.
[4]Lee JM, Trauner M, Soroka CJ, et al. Expression of the bile salt export pump is maintained after chronic cholestasis in the rat. Gastroenterology, 2000, 118: 163-172.
[5]Trauner M, Arrese M, Soroka CJ, et al. The rat canalicular conjugate export pump (Mrp2) is down-regulated in intrahepatic and obstructive cholestasis. Gastroenterology, 1997, 113: 255-264.
[6]Kikuchi S, Hata M, Fukumoto K, et al. Radixin deficiency causes conjugated hyperbilirubinemia with loss of Mrp2 from bile canalicular membranes. Nat Genet, 2002, 31: 320-325.
[7]Kojima H, Nies AT, Konig J, et al. Changes in the expression and localization of hepatocellular transporters and radixin in primary biliary cirrhosis. J Hepatol, 2003, 39: 693-702.

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