【摘要】目的观察实验性大鼠肝硬化形成过程中，肝组织瘦素及瘦素功能性受体表达的动态变化以及与肝内胶原含量的关系。方法经皮下注射四氯化碳（0.3 ml/100 g体重，每周2次）复制肝硬化动物模型,于第0、3、6、9、12周各处死一批大鼠。用RTPCR检测各期动物肝组织中瘦素及瘦素功能性受体(ob-Rb)mRNA表达水平。用免疫组织化学方法检测各期动物肝组织中瘦素、瘦素受体的表碉和定位，用放射免疫法检测各期动物血浆中透明质酸(HA)、瘦素水平。运用MPIAS500多媒体真彩色图像分析系统作肝内胶原定量分析。结果正常肝组织中有少量瘦素、瘦素功能性受体的mRNA表达, 随着肝硬化的形成，各期表达量逐渐递增（与0周比较，P<0.01）。正常肝组织可见瘦素及瘦素受体在血管周围、汇管区及肝索间质细胞的细胞质和细胞膜有少量表达，随着肝硬化的形成, 瘦素、瘦素受体表达增多、增强（P<0.01）。随着造模时间的增加，肝内胶原面积、血浆中HA和瘦素均逐渐增加，各期比较差异有统计学意义(P<0.05)。肝硬化形成过程中，肝脏中瘦素、瘦素功能性受体的mRNA表达水平与血浆中HA水平及肝内胶原含量呈正相关（瘦素与HA：r=0.726，P=0.00；瘦素与胶原：r=0.732，P=0.00；ob-Rb与HA:r=0.705，P=0.00；ob-Rb与胶原：r=0.764，P=0.00）。结论在四氯化碳诱导的大鼠肝硬化形成过程中，瘦素及功能性受体的基因和蛋白表达增加，并随肝硬化程度的加重而逐步升高，从而促进肝硬化的发生。 【关键词】瘦素; 瘦素受体; 肝硬化 A Study on the expression of leptin and its functional receptors in expremental liver cirrhosis in ratsLI Shangao, SI Shuying, YU Leimin, FAN Yihong, MENG Lina, LV Bin.Department of Gastroenterlogy,The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310006, China Corresponding author:LI Shangao, Email:galisga@yahoo.com.cn 【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of leptin and the long form of leptin receptor (ob-Rb) in the fibrotic liver,and to investigate the effect of leptin and ob-Rb in hepatic tissue during the process of experimental liver cirrhosis in rats.MethodsThirtyeight male SD rats were randomized devided into control group (6 rats) and model group (32 rats) . Control group was sacrificed at the beginning of the experiment. In model group 60% CCl4 in olive oil was injected subcutaneously twice per week at the dosage of 0.3 ml/100 g body weight .Sixeight rats were sacrificed each time at the end of 3th、6th、9th、12th week after administration of CCl4 and liver tissues were taken for pathological examination.Expression of leptin and ob-R protein was measured by immunohistochemistry. Gene expression of leptin and ob-Rb was detected by reversetranscription polymerase chain reaction ( RTPCR). The levels of hyaluronate acid(HA)and leptin in blood plasma were measured by radioimmunity.Collagen quantitative analysis in liver tissues measured by multimedia kromgram image analysis system(MPIAS500).ResultsThe leptin and ob-Rb mRNA were small amounts expression in the normal liver tissues, and increased after CCl4 treatment（compared with 0 week，P<0.01）. Leptin and ob-Rb was slightly expressed in the portal, perivascular and hepatic cord area of the normal liver, located in the cytoplasm and cell membrane of mesenchymal cells. It was upregulated in the portal area, the perisinus of the lobule and the hepatic septum in the rats with the CCl4 treatment.HA（ng/ml）（31.553±18.928, 136.653±39.861,144.805±42.051,155.309±80.527,190.907±96.273）,Leptin(ng/ml)（8.005±1.028,10.665±1.827, 11.536±2.739, 13.2±1.904, 11.207±2.293） and collagen quantitative analysis in liver tissues（249.667±43.445，1023.9±24.596,1526.313±42.772,2045.913±100.623,2262.25±103.586） increased after CCl4 treatment. The levels of leptin and ob-Rb mRNA were correlated with HA positively (leptin:r=0.726，P=0.00;ob-Rb:r=0.705，P=0.00). The levels of leptin and ob-Rb mRNA were correlated with collagen amount in liver tissues positively (leptin：r=0.732,P=0.00； ob-Rb：r=0.764, P=0.00).ConclusionIn the process of the hepatic fibrosis induced by CCl4 in rats, expression of leptin and ob-Rb were elevated and correlated with fibrosis stage promote the fibrosis positively. 【Key words】Leptin； Long form of leptin receptor； Hepatic fibrosis 瘦素(leptin)是由肥胖基因所编码的一种由167个氨基酸组成的分泌型蛋白质。近年来研究显示瘦素与纤维化形成有关［1］。本实验用四氯化碳(CCl4)诱导大鼠肝硬化动物模型，探讨leptin在肝纤维化/肝硬化发生过程中的可能作用及机制。材料与方法 一、CCl4肝硬化模型的制备 SD大鼠38只，雄性，体重170～230 g，由中国医学科学院上海实验动物中心提供，饲养于浙江中医药大学实验动物中心。在饮水中加入苯巴比妥钠（0.4 g/L）作为惟一水源，于实验开始时随机抽取6只，作为正常0周观察组，其余大鼠皮下注射60%CCl4 0.3 ml/100 g,每周2次,复制肝硬化动物模型。 二、标本处理 动物于造模开始时0、3、6、9、12周分别处死一批动物，每次6～8只。每批动物处死时均经1％戊巴比妥钠麻醉后（50 mg/kg），切开腹腔，经下腔静脉取血，离心后取血清，置-20℃冰箱待测相关指标。取肝组织部分置4%甲醛中固定，以留作病理检查，部分于液氮中保存，以备提取mRNA和蛋白质。 三、药品 CCl4（分析纯，由武汉化学试剂公司出品），临用前用橄榄油稀释，配成体积百分比为60%的溶液，四甲基吡嗪由无锡第七制药厂生产，临用前用5%葡萄糖配制成1%的溶液。 四、主要试剂及仪器 Trizol试剂、逆转录试剂盒购置于 Invitrogen公司；免疫组化试剂：leptin、瘦素受体(ob-R)一抗购自美国Santa Cruz公司，所有二抗均由上海仪涛生物仪器有限公司提供。 GNP9050型隔水式恒温培养箱（上海精密实验设备有限公司），基因扩增仪（美国MJ公司），蛋白垂直电泳和转膜系统（美国BioRad公司），凝胶成像系统（美国BioRad公司），SAKURA牌Tissue Tek VIP 自动脱水机，SAKURA牌TissueTek TEC包埋机，Leica LEICARM 2135（德国）。 五、主要指标检测 (一) RT-PCR 法检测肝组织中leptin及瘦素功能性受体(ob-Rb) mRNA表达以β-actin 为内参物,采用RT-PCR 法检测leptin mRNA表达,扩增条件为:94℃,30 s;60℃,30 s,72℃,30 s;共30个循环。leptin引物序列:正向引物：5′TTGGCCCTATCTTTTCTATG3′,反向引物：5′GCATACTGGTGAGGATCTGT3′,扩增片段长度为232 bp。取10 μl PCR产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳后,用凝胶成像系统对leptin和内参物β-actin扩增条带扫描并用Quantity One软件计算基因相对表达值。leptin基因相对表达量=(leptin基因条带面积×条带灰度) /(β-actin基因条带面积×条带灰度) 以β-actin 为内参物,采用RT-PCR 法检测ob-Rb mRNA的表达情况,扩增条件为:94℃,30 s;50℃,1 min,72℃,30 s;共30循环。ob-Rb引物序列:正向引物：5′ TTGTGCCAGTAATTATTTCCTCTT 3′,反向引物：5′AGTTGGCACATTGGGTTCAT3′,扩增片段长度为200 bp。取10 μl PCR 产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳后,采用相同的方法来分析ob-Rb mRNA的表达水平。 (二） 免疫组织化学法检测肝组织中leptin及ob-R的表达采用二步法（EnVision系统），基本工作程序为：脱蜡，水化组织片；预处理组织切片（据一抗具体说明而定），酶修复或热修复；蒸馏水漂洗，置于PBS中；滴加3％的H2O2阻断内源性过氧化物酶，孵育10 min；蒸馏水漂洗，置于PBS中；一抗孵育10 min或30 min；TPS漂洗10 min；EnVision TM 孵育10或30 min；TBS漂洗10 min；色源底物溶液DAB孵育，光镜控制；蒸馏水漂洗；复染或封片。指标判断如下：表达的阳性结果根据细胞染色强度来判断,将染色强度分为:不染色0;轻度染色1;中度染色2;重度染色3。 (三） 血浆中leptin和透明质酸(HA)水平采用北京北方生物技术研究所提供的瘦素和HA放射免疫测试盒，测定血清中leptin和HA水平（按说明书操作）。 (四） 肝内胶原定量分析取肝组织置10％甲醛中固定，石蜡包埋，切片，VG染色（不染胞核），运用日本MPIAS500多媒体真彩色图像分析系统作肝内胶原定量分析，以171 814.312 5 μm2作为一个标准视野，每张切片随机选取3个视野，测定肝内胶原面积，然后取均值。 六、统计学处理 计量资料采用均数±标准差（±s）表示，以SPSS 11.0统计软件对计量资料行组间方差分析及线性相关分析，对计数资料行非参检验。 结果 一、肝组织leptin及ob-Rb mRNA表达的动态变化 RTPCR检测结果显示，正常肝组织中有少量leptin及ob-Rb mRNA表达(leptin：0.43±0.45, ob-Rb：0.57±0.21),随着肝纤维化及肝硬化的形成, 3、6、9、12周肝脏中leptin及ob-Rb的mRNA表达逐渐增加（与0周比，P<0.01）。结果见图1、表1。 图1（略）表1（略） 二、肝组织leptin及ob-R表达的变化 免疫组织化学染色显示leptin及ob-R的阳性表达部位位于细胞胞质和胞膜,表现为棕黄色细颗粒沉积。正常肝组织可见leptin及ob-R在血管周围、汇管区及肝索间质细胞的细胞质和细胞膜有少量表达;随着肝纤维化及肝硬化的形成,在模型大鼠肝脏的汇管区 、纤维间隔、小叶内血管、胆管、肝窦周围leptin及其受体的表达明显增加,且3、6、9、12周肝组织中两者的表达强度呈明显递增趋势(P<0.01)。结果见图2 、表2。 图2（略）表2（略） 三、血浆中leptin和HA水平的变化(见表3) 随着造模时间的增加，血浆中leptin和HA水平明显增加,各期比较差异有统计学意义(P<0.05) 四、肝内胶原面积 随着造模时间的增加，肝内胶原面积（μm2）显著增大（见表3）。表3（略） 五、肝组织leptin及ob-Rb mRNA 表达水平与HA及肝内胶原含量的关系 肝硬化形成过程中，肝脏中Leptin和ob-Rb的mRNA表达水平与血浆中HA水平及肝内胶原含量呈正相关（leptin与HA：r=0.726，P=0.00；leptin与胶原：r=0.732，P=0.00；ob-Rb与HA:r=0.705，P=0.00；ob-Rb与胶原：r=0.764，P=0.00）。 讨论 leptin作为一种肽类激素,其生物学效应由ob-R介导。目前已发现有长型受体（ob-Rb)及不同剪接（ob-Ra、c、d、e、f、g)等7种形式，其中ob-Rb是主要的功能性受体。leptin主要通过与ob-Rb结合发挥作用。 近年研究发现leptin与肝纤维化的发生有密切关系。Otte等［2］以苯巴比妥和不断增加的CCl4诱导大鼠肝纤维化模型，其体内活化的肝星状细胞均可表达leptin，且leptin可增加肝纤维化和前胶原稳态mRNA表达。Mccullough等［3］报道酒精性肝硬化患者血清leptin水平增高。本实验发现，在CCl4诱导的肝硬化大鼠模型中，血浆leptin水平、肝组织中leptin和ob-Rb的mRNA表达均明显增加，且随着CCl4诱导时间的延长呈递增趋势。肝脏leptin和ob-Rb mRNA表达水平与血浆中HA及肝内胶原含量均呈正相关。肝组织中leptin和ob-R的免疫组织化学研究也取得上述同样的结果。提示leptin和ob-Rb参与肝硬化形成过程。 本研究发现正常肝组织有少量leptin基因和蛋白表达，与文献报道leptin在活化的肝星状细胞(HSC)中表达［4］结果不同，但HSC仅作为leptin的来源抑或是leptin自分泌/旁分泌直接效应细胞仍有争议。Ikejima等［5］研究发现HSC表达的是ob-Ra ,而不是功能性受体ob-Rb，外源性leptin不能促进HSC的STAT3磷酸化与α1（I）前胶原基因表达；推测HSC是leptin来源而不是直接效应细胞。Saxena等［1］研究认为在外源性leptin刺激下，HSC的STAT3磷酸化与α1（I）前胶原基因表达增加，在JAK2阻滞剂AG490阻断ob-Rb磷酸化后，leptin诱导的HSC增殖受到抑制，提示leptin直接作用于HSC促进肝纤维化的发生。本研究未进行HSC 的特异染色,所以还不能明确ob-R是否只在HSC特异表达,窦内皮细胞和库普弗细胞是否表达ob-R,仍需进一步研究证实。本研究中所用的ob-R抗体,与长型和短型受体的共有序列特异结合,故不能将两者区分,应采用ob-Rb特异抗体进行免疫组织化学染色,以明确ob-Rb在肝脏中的表达。 Tang等［6，7］研究发现，外源性瘦素能促进人HSC细胞株表达转化生长因子-β(TGF-β)Ⅱ型受体；与TGF-β1同时作用于细胞株时，将使TGF-β1促胶原合成的效应放大至单独作用时的3.5倍，表明leptin致肝纤维化机制与TGF-β1密切相关，二者有协同作用。目前关于leptin和ob-Rb在肝纤维化/肝硬化形成过程中具体作用机制还不明确。瘦素可能通过直接作用于HSC上的功能性受体或经其他细胞因子，如TGF-β1等介导发挥作用，但确切机制尚需进一步研究。 参考文献 1Saxena NK, Ikeda K, Rockey DC, et al. Leptin in the hepatic fibrosis: evidence for increased collagen production in stellate cells and lean littermates of mice .Hepatology, 2002,35∶762-771. 2Otte C, Otte JM, Strodthoff D, et al. Expression of leptin and leptin receptor during the development of liver fibrosisand cirrhosis .Exp Clin Endocrinol Diabetes, 2004,112∶10-17. 3Mccullough AJ,Bugianesi E,Marchesini G,et al. Gender dependent alterations in serum leptin in alcoholic cirrosis. Gastroenterology,1998,115∶947-953. 4Honda H, Ikejima K, Hirose M,et al. Leptin is required for fibrogenic responses induced by thioacetamide in the murine liver. Hepatology,2002, 36∶12-21. 5Ikejima K, Takei Y, Honda H, et al. leptin receptor 2 mediated signaling regulates hepatic profibrogenic and remodeling of extracellular matrix in the rat .Gastroenterology, 2002,122∶1399-1410. 6Tang M, Potter JJ, Mezey E. Leptin enhances the effect of transforming growth factor beta in increasing type I collagen formation.Biochem Biophys Res Commun,2002，297∶906-911. 7Tang M, Potter JJ, Mezey E. Activation of the human alphal(I) collagen promoter by leptin is not mediated by transforming growth factor beta responsive elements. Biochem Biophys Res Commun,2003，312∶629-633. 上海《肝脏》杂志社版权 |