【摘要】目的构建1.3拷贝乙型肝炎病毒(HBV)拉米夫定耐药株的重组逆转录病毒载体及其包装细胞系。方法在野毒株1.3拷贝HBV载体的基础上采用定点突变的方法将rtL180M，rtM204V位点突变，构建拉米夫定耐药病毒株，并通过PCR、限制性内切酶酶切，分别以正向和反向将野毒株和耐药株分别连接于逆转录病毒载体pLNCX2的相应酶切位点，构建成重组逆转录病毒载体，经双酶切及PCR扩增鉴定。重组载体转染包装细胞，筛选培养细胞克隆并进行病毒滴定。结果通过双酶切、PCR扩增、测序鉴定证实成功构建了1.3拷贝HBV拉米夫定耐药株的逆转录病毒载体。成功建立包装细胞系并测得病毒滴度均为1×105 cuf/ml。 结论含正向及反向1.3拷贝HBV拉米夫定耐药的重组逆转录病毒载体及其包装细胞系构建成功，可以用于拉米夫定耐药细胞模型研究。
【关键词】乙型肝炎病毒； 拉米夫定耐药； 逆转录病毒载体; 包装细胞系
Construction of recombinant retrovirus vector containing 1.3foldoverlength genome of lamivudineresistant HBV and establishment of its packaging cell lineLIN Zhanzhou, WANG Zhanhui， ZHOU Bin， YANG Fuqiang, YU Zhijian, HOU Jinglin.Department of Infectious Diseases, Nanfang hospital , Southern Medical University，Guangzhou 510515， China
【Abstract】ObjectiveTo Construct recombinant retrovirus vector containing 1.3foldoverlength genome of lamivudineresistant HBV and its packaging cell line.MethodsThe 1.3foldoverlength genome of lamivudineresistant HBV was obtained by the method of sitedirected mutagenesis base on the 1.3foldoverlength genome of wild strain HBV.The corresponding mutation in the HBV reverse transcriptase domain of the polymerase are L180M and M204V.Then it was inserted into the retrovirus pLNCX2 vector cloning site in the sense or antisense orientation respectively with recombinant technigue. PT67 cells were transfected with the recombinant retrovirus vectors. The virus titers of packaging cell lines were determined by infecting NIH3T3 cells.ResultsThe recombinant retrovirus vector carrying sense or antisense 1.3foldoverlength genome of lamivudineresistant HBV have been constructed. It have been identifed by restriction enzyme digestion and electrophoretic analysis fragments of PCR amplification and DNA sequence were checked with automatic sequenator. The virus titers of packaging cell lines were about 1×105 cuf/ml.ConclusionThe recombinant retrovirus vector carrying sense or antisense 1.3foldoverlength genome of lamivudineresistant HBV and its packaging was constructed successfully.It would apply to the study of lamivudineresistant cell lines.
【Key words】Hepatitis B virus; Lamivudineresistant; Retrovirus vector; Packaging cell line
拉米夫定为上市最早、应用最为广泛的核苷（酸）类似物，长期使用拉米夫定治疗慢性乙型肝炎易发生乙型肝炎病毒(HBV)YMDD变异而导致耐药。核苷（酸）类似物耐药为目前慢性乙型肝炎抗病毒治疗中所面临的主要难题之一，因此建立核苷（酸）类似物耐药株细胞模型对抗病毒药物的开发、评价，耐药机制的研究有重要意义。由于HBV感染有高度的种属和组织特异性，动物模型缺乏，因此建立HBV转染细胞模型成为目前首选的研究方法［1］。而已有的HepG2.2.15细胞株等细胞模型因仅表达野生株HBV，在耐药相关研究中受限制。本研究通过定点突变的方法，将1.3倍的已知序列野生株HBV定点突变为拉米夫定耐药株，分别以正向和反向两种方式插入逆转录病毒载体，构建出含正向和反向1.3拷贝野生株以及拉米夫定耐药HBV的重组逆转录病毒载体，为今后建立拉米夫定耐药细胞模型奠定基础。
材料与方法
一、主要材料
（一） 质粒和菌株含1.3拷贝C基因型HBV的pFastBac1.3 HBV重组杆状病毒载体，由我室参考Guidotti等［2］文献报道的方法构建。RetroXTM逆转录病毒载体系统（含逆转录病毒载体pLNCX2及PT67包装细胞）购自Clontech公司。感受态大肠杆菌DH5α购自鼎国生物制剂公司。
（二） 主要试剂与仪器常规限制性内切酶及T4连接酶等工具酶购自TaKaRa公司。定点突变试剂盒Quickchange XL SiteDirected Mutagenesis Kit购自Stratagene公司。质粒提取试剂盒、胶回收纯化试剂盒购自TANGEN公司。HBsAg ELISA试剂盒为潍坊3V公司产品。聚凝胺购自SIGMA公司。PCR仪为Applied Biosystems的GeneAmp PCR system 9700。电泳仪为美国BIORAD产品。紫外凝胶成像系统为UVITEC公司产品。
二、实验方法
(一) 目的基因片段1.3倍拉米夫定耐药HBV的构建rtM204位点突变：设计并合成正向突变引物YVS 5′GCTTTCAGTTATGTGGATGATGTGG3′, 反向突变引物YVA 5′CCACATCATCCACATAACTGAAAGC3′。参照定点突变试剂盒说明书，突变反应总体系50 μl：10×Buffer 5 μl, pFastBac1.3HBV载体DNA 2 μl,引物YVS 1 μl，引物YVA 1 μl，dNTPs 1 μl，QuikSolution 3 μl，PfuTuboDNA聚合酶1 μl，ddH2O 37 μl。循环参数为95℃ 预变性1 min，95℃变性50 s，60℃退火50 s，68℃延伸9 min，15个循环，68℃再延伸10 min。用Dpn Ⅰ对PCR产物进行酶切去除模板链。产物转化感受态DH5α细菌，含100 μg/ml氨苄青霉素LB平板筛选培养，37℃过夜，挑取菌落，PCRRFLP方法鉴定所挑取菌落含HBV DNA片段，扩增后提取质粒（质粒提取过程按试剂盒说明书进行）。
rtL180M位点突变：挑取上述经PCRRFLP方法鉴定的正确质粒行180位点突变。设计并合成正向突变引物526MS 5′GTCCGTTTCTCATGGCTCAGTTTAC3′, 反向突变引物526MA 5′GTAAACTGAGCCATGAGAAACGGAC3′。PCR反应体系、循环参数等方法同上述。
（二） 含反向1.3拷贝拉米夫定耐药HBV的重组逆转录病毒载体的构建含目的基因的重组杆状病毒载体质粒与逆转录病毒载体pLNCX2进行Hind Ⅲ及Sal Ⅰ双酶切，电泳后切胶纯化回收目的片段，T4连接酶连接并转化，挑取克隆，扩增后提取质粒。命名为pRVYMDD HBV。
（三） 含正向1.3拷贝拉米夫定耐药HBV的重组逆转录病毒载体的构建设计引物扩增出1.3拷贝拉米夫定耐药HBV，并使PCR产物5′带有Hind Ⅲ位点，3′带有Sal Ⅰ位点，所扩得产物经Sal Ⅰ及Hind Ⅲ双酶切，电泳后切胶纯化回收目的片段，与逆转录病毒载体pLNCX2经T4连接酶连接并转化，挑取克隆，扩增后提取质粒。命名为pRV+YMDD HBV。
（四） 包装细胞系的建立及病毒浓度滴定将两种重组载体用脂质体的方法转染PT67包装细胞，经G418筛选培养2周，挑取的细胞克隆于6孔板中培养，待细胞70％～80%汇合，更换不含G418上清，培养48 h，所得上清经0.45 μm孔径滤器过滤后，按10～106倍不同浓度稀释，并加入聚凝胺使其终浓度达到4 μg/ml，感染NIH3T3细胞，24 h后开始使用含G418的完全培养基培养筛选。
结果
一、YMDD突变位点鉴定
使用我科设计的PCRRFLP方法［3］，行PCR反应，产物经Nde Ⅰ内切酶消化后电泳。图1显示产物未能被Nde Ⅰ内切酶消化，即为突变成功。
第1泳道为含正向1.3拷贝拉米夫定耐药HBV的重组逆转录病毒载体pRV+YMDD HBV的PCR产物，第2泳道为含反向1.3拷贝拉米夫定耐药HBV的重组逆转录病毒载体pRVYMDD HBV的PCR产物，第3泳道为YMDD变异株的PCR产物，第4泳道为野毒株的PCR产物，被Nde I内切酶切开。图1（略）
二、重组载体限制性内切酶鉴定
所构建重组逆转录病毒载体使用Hind Ⅲ及Sal Ⅰ双酶切，产物行琼脂糖凝胶电泳。图2可见两条带，约4 kb的片段与1.3拷贝HBV 4.1 kb的理论预计值相符，同时约6 kb的片段与载体pLNCX2的6.1 kb理论预计值相符。
1、2泳道分别为pRV+YMDD HBV酶切产物，3、4泳道为pRVYMDD HBV酶切产物，第5泳道为空的pLNCX2载体酶切产物，第6泳道为pFastBac1.3 HBV重组杆状病毒载体酶切产物，第7泳道为Marker，1～10 kb。图2（略）
三、PCR及测序鉴定
使用逆转录病毒系统试剂盒所带引物对载体多克隆位点片段进行PCR扩增，图3可见一约4 kb的片段，与1.3倍HBV 4.1 kb的理论预计值相符。产物送上海英骏公司用5条相关引物测序，结果比对鉴定序列正确，证实定点突变成功。
第1泳道为Marker，第2泳道为pRV+YMDD HBV的PCR产物，第3泳道为pRVYMDD HBV的PCR产物。Marker最大条带为5 kb。图3（略）
四、逆转录病毒的包装
转染24 h后开始G418筛选培养2周后存活数个细胞克隆，各挑取克隆于6孔板中，继续加入G418扩大培养。待细胞70％～80%汇合，更换无G418培养基，再培养48 h，所得上清用ELISA试剂盒测定HBsAg表达，未转染的PT67细胞培养上清为对照，pRV+YMDD HBV转染细胞所得克隆最高A值为0.374，而pRVYMDD HBV则为0.234(临界值0.082)。
五、逆转录病毒滴度测定
将上述HBsAg表达最高含病毒上清分别感染NIH3T3细胞，G418筛选10 d后，于10～105倍浓度稀释含病毒上清感染的培养孔中均有细胞克隆形成，但因细胞克隆融合生长，无法分辨具体克隆数目，106倍浓度稀释上清所感染的培养孔则无细胞生长，即考虑病毒滴度约在1×105 cuf/ml。
讨论
HBV为闭合环状双链DNA，不同的阅读框有重叠，在转为线性目的基因并转入载体时，无论从何处切开均有阅读框不能完全正确阅读，故已有的研究，包括HepG2.2.15细胞株，均使用拼接的、超过正常、甚至多倍的HBV DNA。考虑载体容量，基因片断愈小愈容易整合入载体中。但Guidotti等［2］研究表明1.3倍长的HBV DNA比最小所需的1.2倍更高表达HBV，因此本研究中的1.3拷贝HBV基因在其5′末端包含增强子I及增强子II、复制起点、X及前C启动子基因、前基因RNA转录起始位点、特异多腺苷酸化位点以及完整的X开放读框。考虑载体5′上游往往带CMV强启动子，可能干扰目的基因各个不同阅读框表达，或致其表达不平衡，参考Weiss等［4］构建HepG24A5细胞株时所用方法，在载体中将目的基因与筛选标志相反方向放置，故本研究分别构建了含正向和反向目的基因的重组表达载体。
本研究选用已知序列基因片段进行突变，是为了获得来源、结构清楚的目的基因。Stratagene公司的QuikChange XL sitedirected mutagenesis kit，通过设计一对包含突变位点的引物（正、反向），与模板质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，再经过反复加热退火延伸的循环，正、反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。Dpn I酶切延伸产物，由于原来的模板质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对Dpn I敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。而Pfu聚合酶能够有效避免延伸过程中的错配。试剂盒采用的是低次数的循环延伸而非PCR，有助于减少无意错配。
本研究采用逆转录病毒载体，更容易得到稳定的细胞株。逆转录病毒载体带有neo标记基因供阳性筛选用，其多克隆位点上游带CMV强启动子，转染相应包装细胞后，可包装出重组逆转录病毒，通过病毒膜糖蛋白和宿主细胞表面的受体相互作用而进入宿主细胞，介导目的基因转染到分裂细胞。逆转录病毒载体介导逆转录病毒进入宿主细胞的受体，在细胞表面广泛存在，可以高效率地将目的基因插入细胞基因组 。所建立的包装细胞系HBsAg表达低，考虑为PT67细胞而非HBV特异宿主细胞。
我们通过酶切、PCR及测序，已鉴定含正向和反向1.3拷贝拉米夫定耐药HBV的重组逆转录病毒载体构建成功，并成功建立其包装细胞系，下一步将用于建立拉米夫定耐药细胞模型。
参考文献
1Tang H,Mclachian A.Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism.Proc Natl Acad Sci USA，2001,98∶1841-1846.
2Guidotti LG,Matzke B,Schaller H,et al.Highlevel hepatitis B virus replication in transgenic mice.J Virol，1995,69∶6158-6169.
3孙剑，侯金林，肖蕾，等.PCR-RFLP结合克隆测序监测乙肝病毒拉米夫定耐药突变株的产生.中华微生物学和免疫学杂志，2001，21∶654-656.
4Weiss L,Kekule AS,Jakubowski U,et al. The HBVproducing cell line HepG 24A5: A new in vitro system for studing the regulation of HBV replication and for screening antihepatitis B virus drugs. Virology,1996, 216∶214-218.
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